地方性饮水型砷中毒是我国主要的地方病之一。近年来，砷对中枢神经系统的毒性作用引起了人们的广泛关注。临床研究、流行病学调查和动物实验研究均显示长期砷暴露可引起人和实验动物的行为异常和智力障碍。但迄今为止，砷致学习记忆损害的分子机理尚不十分清楚。　　 突触是神经元间相互联系及信息传递的特化结构，是神经系统可塑性变化最敏感的部位。海马的长时程增强（long-term potentiation，LTP）是学习记忆的重要神经生物学基础和在突触水平上的研究模型。谷氨酸（glutamate，Glu）是中枢神经系统中含量最高的一种氨基酸类神经递质，其在LTP的诱导与维持中起关键作用。突触后膜上的Glu受体主要包括:α-氨基羟甲基恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate，AMPA）受体和N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体，当高频刺激促使突触前膜大量释放Glu，其首先作用于突触后膜的AMPA受体，使突触后膜去极化，导致堵塞在NMDA受体通道中的Mg2+脱落，当Glu与NMDA受体结合后，使其通道开放，Ca+大量内流，进入突触后膜的Ca2+进一步激活Ca2+/CaM-Ca2+/CaMKⅡ信号转导系统，诱导LTP。同时，突触后膜产生大量的逆行信使，如一氧化氮(nitric oxide，NO)等，其反馈作用于突触前膜的效应蛋白激酶，促使突触前膜释放更多的Glu，维持LTP。所以，突触后膜AMPA和NMDA受体的表达对于LTP的诱导与维持起着十分关键的作用。NMDA受体主要由NR1和NR2A-D等亚基构成，其中NR1是功能亚单位，NR2是调节亚单位，NR2本身虽不具有NMDA受体的功能，但当其与NR1聚合后可影响NMDA受体的功能特性。NMDA受体介导的Ca2+内流可激活钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)，并可使其与NMDA受体的NR1和NR2B结合，磷酸化NR2B，CaMKⅡ自身的苏氨酸位点也可被磷酸化，并激活CaMKⅡ下游信号传导通路，参与突触可塑性的调控。海马中，AMPA受体的构成主要为GluR1/GluR2和GluR2/GluR3。　　 突触后致密蛋白(postsynaptic density protein，PSD)是位于突触后膜下方与胞质相连的一层致密物质，PSD-95是突触后膜蛋白复合体结构中的主要支架蛋白，PSD不仅与LTP诱导和维持密切相关，也是反映突触发育的重要指标。突触素（synaptophysin，SYP）是位于突触前囊泡膜上的钙结合蛋白，与突触的结构和功能密切相关。SYP可作为突触前膜的特异性标记物，用来检测突触的密度和分布。　　 基于以上理论分析，本研究以昆明种小鼠为研究对象，通过探讨砷对突触前后膜上相关蛋白表达的影响，揭示砷对不同发育阶段子代小鼠海马中突触的损伤及其可能的机制，为揭示砷暴露对脑学习记忆功能损伤的可能机制提供实验参考数据。　　 方法:　　 1、实验动物分组与染毒　　 选择健康、清洁级昆明种小鼠的孕鼠80只，随机分成对照组及25、50和100mg/L NaAsO2染毒组。从受孕第一天开始以自由饮水方式染砷，对照组孕鼠饮蒸馏水。分娩后，各实验组的母鼠和仔鼠继续饮含砷水至实验结束。　　 2、指标测定　　 乙醚麻醉后，分别断头处死出生后(postnatal day, PND)7、14、21和35天的仔鼠，快速取脑组织，低温下剥离双侧海马，称重。　　 2.1海马中砷形态含量测定　　 采用氢化物发生-超低温捕集-原子吸收分光光度法检测不同发育阶段仔鼠海马中各形态砷含量。　　 2.2海马中神经元和突触超微结构观察　　 用2.5％戊二醛和1％锇酸固定仔鼠海马，梯度酒精脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜下观察不同发育阶段仔鼠海马中神经元和突触超微结构的变化。　　 2.3仔鼠空间学习与记忆能力的测定　　 用Morris水迷宫法检测PND35仔鼠的空间学习与记忆能力，测试包括定位航行实验和空间探索实验两个部分。　　 2.4海马中PSD-95和SYP蛋白表达　　 采用Western-blot和免疫荧光组织化学法分别检测不同发育阶段仔鼠海马中各蛋白的表达。　　 2.5海马中NMDA和AMPA受体亚单位的基因和蛋白表达　　 采用Real time RT-PCR、Western-blot和免疫荧光组织化学法分别检测不同发育阶段仔鼠海马中各Glu受体亚单位的mRNA与蛋白表达。　　 2.6海马中CaMKⅡ蛋白表达　　 采用Western-blot法检测不同发育阶段仔鼠海马中CaMKⅡ蛋白的表达。　　 3、统计分析　　 实验数据采用SPSS13.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用q检验(SNK)。以P＜0.05作为差异有统计学意义的判定标准。　　 结果:　　 1、砷暴露对不同发育阶段仔鼠体重增长的影响　　 100 mg/L NaAsO2组的仔鼠体重从PND7开始显著低于对照组，从PND14开始显著低于其他各组;50 mg/L NaAsO2组的仔鼠体重从PND14开始显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组;25 mg/LNaAsO2组的仔鼠体重从PND14开始显著低于对照组。　　 2、不同发育阶段仔鼠海马中砷形态含量的变化　　 各组PND7仔鼠的海马中二甲基砷(dimethylarsinic acid，DMA)含量随染砷剂量的增加而显著升高。各组PND14仔鼠的海马中无机砷（inorganic arsenic，iAs）含量随染砷剂量的增加而升高，50和100 mg/L NaAsO2组的iAs含量显著高于对照组，且100 mg/L NaAsO2组的iAs含量也显著高于25mg/L NaAsO2组。各组PND21仔鼠的海马中各形态砷含量均随染砷剂量的增加而升高，50和100 mg/LNaAsO2组的各形态砷含量均显著高于对照组，且25 mg/L NaAsO2组的DMA含量也显著高于对照组，而100 mg/L NaAsO2组的DMA含量也显著高于25和50mg/L NaAsO2组。各组PND35仔鼠的海马中仅DMA含量随染砷剂量的增加而显著升高，仅100 mg/L NaAsO2组的一甲基砷(monomethylarsonic acid，MMA)含量显著高于对照组。　　 3、砷暴露对不同发育阶段仔鼠海马超微结构的影响　　 透射电镜观察发现，各染砷组仔鼠的海马神经元中核基质染色变深，胞质中细胞器肿胀、空泡化，线粒体中脊减少或无脊及粗面内质网扩张。此外，各染砷组仔鼠的海马突触中小泡数量减少、突触活性带变短及突触后致密物变薄等。上述改变随染砷剂量的增加与时间的延长而加重。　　 4、砷暴露对仔鼠空间学习与记忆功能的影响　　 在定位航行实验中，各组PND35仔鼠的寻找平台潜伏期从训练第3天起，随染砷剂量的增加而延长，且各染砷组与对照组比较差异均有统计学意义;从训练第4天起，100 mg/L NaAsO2组与25 mg/L NaAsO2组比较差异有统计学意义;从训练第5天起，50 mg/L NaAsO2组与25 mg/L NaAsO2组比较差异具有统计学意义，且100 mg/L NaAsO2组与50 mg/L NaAsO2组比较差异也具有统计学意义。　　 在空间探索实验中，各染砷组的PND35仔鼠在第Ⅱ象限停留时间随染砷剂量的增加而减少，但只有100 mg/L NaAsO2组与对照组比较差异有统计学意义。　　 5、砷暴露对不同发育阶段仔鼠海马中PSD-95和SYP蛋白表达的影响　　 各染砷组的PND14、21和35仔鼠的海马中PSD-95蛋白含量均显著低于对照组，其中50 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠也显著低于25 mg/L NaAsO2组，100 mg/L NaAsO2组的各发育阶段仔鼠均显著低于其他各组。　　 各染砷组的PND14、21和35仔鼠的海马中SYP蛋白含量均显著低于对照组，且50 mg/L NaAsO2组的仔鼠显著低于25 mg/L NaAsO2组，100 mg/L NaAsO2组的仔鼠也显著低于25和50 mg/L NaAsO2组。此外，50和100 mg/L NaAsO2组的PND7仔鼠也显著低于对照组。　　 6、砷暴露对不同发育阶段仔鼠的海马CA1区神经元内PSD-95和SYP蛋白表达的影响　　 各染砷组的PND14、21和35仔鼠的海马CA1区神经元内PSD-95蛋白的平均荧光强度均显著低于对照组;其中50 mg/L NaAsO2组的仔鼠在PND7时显著低于对照组，在PND21和35时显著低于25 mg/L NaAsO2组;100 mg/L NaAsO2组的不同发育阶段仔鼠均显著低于其他各组。　　 各染砷组的PND14、21和35仔鼠的海马CA1区神经元内SYP蛋白的平均荧光强度均显著低于对照组;其中50 mg/L NaAsO2组的不同发育阶段仔鼠均显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组;100 mg/L NaAsO2组的不同发育阶段仔鼠均显著低其他各组。　　 7、砷暴露对不同发育阶段仔鼠海马中NMDA受体亚单位mRNA和蛋白表达的影响　　 50和100 mg/L NaAsO2组的各发育阶段仔鼠的NR1 mRNA和蛋白含量均显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组，且100 mg/L NaAsO2组也显著低于50 mg/LNaAsO2组;25 mg/LNaAsO2组的PND14、21和35仔鼠的NR1 mRNA含量显著低于对照组，而25 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠的NR1蛋白含量显著低于对照组。　　 各染砷组的不同发育阶段仔鼠的NR2A mRNA和蛋白含量均显著低于对照组，其中50 mg/L NaAsO2组仔鼠的NR2A mRNA含量也显著低于25 mg/L NaAsO2组;100 mg/L NaAsO2组仔鼠的NR2A mRNA含量在PND7和14时显著低于25mg/L NaAsO2组，在PND21和35时显著低于25和50 mg/L NaAsO2组。各发育阶段仔鼠的NR2A蛋白含量均随染砷剂量的增加而显著降低。　　 50和100 mg/L NaAsO2组的各发育阶段仔鼠的NR2B mRNA和蛋白含量均显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组，且100 mg/L NaAsO2组也显著低于50 mg/LNaAsO2组;25 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠显著低于对照组。　　 8、砷暴露对不同发育阶段仔鼠海马CA1区神经元内NMDA受体亚单位蛋白表达的影响　　 100 mg/L NaAsO2组的各发育阶段仔鼠的海马CA1区神经元内NR1蛋白的平均荧光强度均显著低于其他各组;50 mg/L NaAsO2组均显著低于对照组和25 mg/LNaAsO2组;25 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠也显著低于对照组。　　 各染砷组的不同发育阶段仔鼠的海马CA1区神经元内NR2A蛋白的平均荧光强度均显著低于对照组，且随染砷剂量的增加而显著降低。　　 50和100 mg/L NaAsO2组的各发育阶段仔鼠的海马CA1区神经元内NR2B蛋白的平均荧光强度均显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组，且100 mg/L NaAsO2组显著低于50 mg/L NaAsO2组;25 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠也显著低于对照组。　　 9、砷暴露对不同发育阶段仔鼠海马中AMPA受体亚单位mRNA和蛋白表达的影响　　 50和100 mg/L NaAsO2组的各发育阶段仔鼠的海马中GluR1 mRNA和蛋白含量均显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组，且100 mg/L NaAsO2组显著低于50mg/L NaAsO2组;25 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠显著低于对照组。　　 各染砷组的PND14、21和35仔鼠的海马中GluR2 mRNA和蛋白含量均显著低于对照组，其中50和100 mg/L NaAsO2组显著低于25 mg/L NaAsO2组，且100mg/L NaAsO2组也显著低于50 mg/L NaAsO2组;但各染砷组的PND7仔鼠与对照组比较差异均无统计学意义。　　 50和100 mg/L NaAsO2组的PND14、21和35仔鼠的海马中GluR3 mRNA和蛋白含量均显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组，且100 mg/L NaAsO2组也显著低于50 mg/L NaAsO2组;25 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠显著低于对照组。但各染砷组的PND7仔鼠与对照组比较差异均无统计学意义。　　 10、砷暴露对不同发育阶段仔鼠海马CA1区神经元内AMPA受体亚单位蛋白表达的影响　　 50和100 mg/L NaAsO2组的各发育阶段仔鼠的海马CA1区神经元内GluR1蛋白的平均荧光强度均显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组，且100 mg/LNaAsO2组也显著低于50 mg/L NaAsO2组;25 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠显著低于对照组。　　 各染砷组的PND14、21和35仔鼠的海马CA1区神经元内GluR2蛋白的平均荧光强度均显著低于对照组，其中50和100 mg/L NaAsO2组也显著低于25 mg/LNaAsO2组，且100 mg/L NaAsO2组也显著低于50 mg/L NaAsO2组。但各染砷组的PND7仔鼠与对照组比较差异均无统计学意义。　　 50和100 mg/L NaAsO2组的PND14、21和35仔鼠的海马CA1区神经元内GluR3蛋白的平均荧光强度均显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组，且100 mg/LNaAsO2组也显著低于50 mg/L NaAsO2组;25 mg/L NaAsO2组的PND21和35仔鼠显著低于对照组。但各染砷组的PND7仔鼠与对照组比较差异无统计学意义。　　 11、砷暴露对不同发育阶段仔鼠海马中CAMKⅡ蛋白表达的影响　　 各染砷组的PND14、21和35仔鼠的海马中CaMKⅡ蛋白含量均显著低于对照组，并随染砷剂量的增加而显著降低。其中50和100 mg/L NaAsO2组的PND7仔鼠显著低于对照组和25 mg/L NaAsO2组，且100 mg/L NaAsO2组也显著低于50mg/L NaAsO2组。　　 结论:　　 1、25～100 mg/L NaAsO2饮水砷暴露可对仔鼠的空间学习能力产生明显的损伤。　　 2、25～100 mg/L NaAsO2饮水砷暴露对不同发育阶段仔鼠的海马神经元及其突触产生明显的损伤作用，并随染砷剂量的增加与时间的延长而明显加重。　　 3、饮水砷暴露对不同发育阶段仔鼠海马突触的损伤作用可能与其对突触中PSD-95和SYP蛋白、NMDA和AMPA受体亚单位蛋白表达的抑制作用有关。　　 4、砷暴露对NMDA和AMPA受体亚单位表达的抑制作用表现在基因转录水平。　　 5、饮水砷暴露对仔鼠空间学习能力的影响可能与其对海马突触的损伤及神经元中CaMKⅡ蛋白表达的抑制作用有关。