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第一部分Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶Matriptase及肝细胞生长因子激活剂抑制剂2(HAI-2)在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义目的:研究Matriptase和HAI-2在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞株及临床患者骨髓浆细胞中的表达水平并分析其临床意义。方法:体外培养9种骨髓瘤细胞株,PCR、Western Blot和生物信息数据库检测分析Matriptase和HAI-2 mRNA和蛋白水平;分别收集正常人和多发性骨髓瘤患者的骨髓,采用Ficoll密度梯度离心法分离出人骨髓单个核细胞,再通过CD138磁珠分选出骨髓浆细胞,实时定量PCR检测正常人和多发性骨髓瘤患者的骨髓浆细胞中Matriptase和HAI-2 mRNA的表达,并通过对生物信息数据库及临床病例资料的统计,分析其临床意义。结果:9种骨髓瘤细胞株中Matriptase和HAI-2的表达存在差异,在骨髓瘤细胞株 RPMI-8226、MM.1S、OPM2、L363 中可观察到 Matriptase 明显表达;OCI-MY5、H929中Matriptase有较弱的表达;而骨髓瘤细胞株KMS11、U266、JJN3中未检测到Matriptase表达;在骨髓瘤细胞株RPMI-8226、MM.1S及U266中观察到HAI-2基因明显表达。MM和正常人的骨髓浆细胞中均有Matriptase和HAI-2 mRNA表达,并且与正常对照组相比,MM 组 Matriptase(0.012±0.005 vs.0.601 ± 0.146,P<0.0001)和HAI-2(0.061±0.018 vs 1.157±0.657,P<0.0001)相对表达水平明显降低。对临床病例资料分析显示,Matriptase表达与骨髓瘤Ⅲ期患者的性别、年龄、分型及相关临床指标相比(包括浆细胞比例、血β2微球蛋白、中性粒细胞计数、血小板、C反应蛋白、血红蛋白、血清钙、肌酐、骨质破坏)没有明显统计学差异;血小板计数<100×109/L的Ⅲ期MM患者HAI-2相对表达量明显低于血小板计数≥100×109/L的MM患者(0.0167±0.0163 vs 0.0771±0.0297,P=0.0397)。生物信息数据库结果显示,Matriptase低表达与较差的生存期有关(χ2=3.867,P=0.0493),与疾病进展、复发均无明显统计学差异;HAI-2表达降低与疾病从正常或临床潜伏期发展为恶性浆细胞白血病(PCL)显著相关(正常对照组HAI-2相对表达量为8.943±0.190、意义不明的单克隆丙种球蛋白病MGUS组中HAI-2相对表达量为8.873±0.253、MM组中HAI-2相对表达量为 8.150±0.093 和 PCL 组中 HAI-2 相对表达量为 7.359± 0.411,P=0.006),与对照组相比,MM 复发患者 HAI-2 表达下降(9.605±0.152 vs.10.34±0.067,P<0.0001),另外具有HAI-2较低水平表达的MM患者表现出明显较差的生存结果(χ2=7.777,P=0.0053)。另外我们还发现在健康捐献者中Matriptase的相对表达水平与HAI-2相对表达量呈强正相关性(r=0.886,P=0.033),而在多发性骨髓瘤患者之间则无这种相关性。结论:我们研究发现Matriptase和HAI-2表达水平的降低在多发性骨髓中属于不利指标,并且我们推测Matriptase低表达与骨髓瘤的不良预后有关;HAI-2低表达提示骨髓瘤的恶性进展、复发和不良预后,在临床实践中可用于协助多发性骨髓瘤的进展监测和预后预测。第二部分多发性骨髓瘤中HAI-2甲基化修饰及功能研究目的:为了研究HAI-2在MM中低表达的现象是否是由于基因高甲基化所引起的,因此我们拟探究MM细胞中抑癌基因HAI-2的甲基化水平,分析其去甲基化后对基因表达及细胞生物学功能的影响及可能的机制。方法:提取MM标本和细胞基因组DNA,亚硫酸盐修饰纯化,特异性甲基化PCR(MSP)检测抑癌基因HAI-2的甲基化情况。加用5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza)刺激KMS11、OPM2、U266细胞,观察甲基化情况是否被逆转;实时定量PCR检测HAI-2基因表达水平;Western Blot分析肝细胞生长因子(HGF)下游信号通路的改变;CCK8法检测细胞增殖情况。结果:9种骨髓瘤细胞HAI-2的甲基化修饰情况存在差异,其中KMS11、OPM2、U266、L363细胞株中出现甲基化,RPMI-8226中观察到非甲基化,而在其余的细胞株(MM.1S、H929、OCI-MY5、JJN3)中均为半甲基化。加用 5-Aza 刺激 KMS11、OPM2、U266细胞后,甲基化情况均被逆转且HAI-2 mRNA表达水平均有不同程度的升高。5-Aza刺激骨髓瘤细胞KMS11和U266细胞5d后,Met的磷酸化水平随着药物浓度的增加而降低。加不同浓度5-Aza处理3d后,三种骨髓瘤细胞活力均显著降低。另外共收集多发性骨髓瘤患者8例,正常健康骨髓捐献者3例,其中正常人和MM患者的骨髓浆细胞中HAI-2均呈半甲基化。结论:多发性骨髓瘤中HAI-2基因存在甲基化修饰。加入去甲基化药物5-Aza可增加HAI-2的表达水平,并可抑制骨髓瘤细胞增殖。研究提示5-Aza可抑制HGF/Met信号通路,有可能是通过HAI-2介导,但这需进一步实验验证。