地黄(Rehmannia glutinosa L.)是以块根入药的玄参科多年生草本植物,近年来随着中药养生等思想的兴起,地黄等常用中药材的需求量越来越大,产生的经济效益也越来越多,但道地产区的限制与连作障碍的危害严重制约了地黄的产量,降低了地黄的品质。因此设法解决地黄连作问题并提高产量和品质是许多研究者共同的目标。本研究以广泛种植的温“85-5”为实验材料,做了以下研究以期揭示地黄产生连作障碍的分子机制。1.地黄根部特异响应连作基因的筛选及鉴定。A.候选基因筛选。利用前期盆栽试验所构建的五种不同胁迫处理(连作、阿魏酸、盐、干旱、涝害)和五个不同时期(苗期、拉线期、膨大前期、膨大中期和膨大后期)的基因数字表达谱文库(DGE),筛选特异响应连作障碍的基因。头茬地黄与连作、阿魏酸、盐、干旱、涝害五种胁迫比较分别筛选到2502、1956、2672、2485、7249个差异表达基因,排除后四种胁迫共有差异表达基因,筛选到连作特异响应基因共678个。头茬、连作地黄以各自苗期为对照,在拉线期、膨大前期、膨大中期和膨大后期中,头茬筛选到3971、4403、3966、8190个差异表达基因,连作筛选到8595、7820、7792、12038个差异表达基因。头茬、连作同一时期分别有7651、2090、600、3674、8433个显著差异表达基因,排除在生长发育过程中表达水平正常波动的基因,得到4398个与连作相关的差异表达基因。将五种胁迫处理和五个时期处理筛选到的678个和4398个连作特异表达基因取交集,得到80个差异基因,功能分析发现,部分基因参与到根细胞物质分泌及胞吞作用,结果可能暗示,地黄根部对化感自毒物质的识别和吸收,是制约连作地黄根部发育的重要因素。B.候选基因鉴定。利用土壤浸提液处理地黄无菌苗,检测49个候选基因(在80个候选基因中|log2 ratio|≥2)对地黄根际周围土壤水溶性浸提物的应答。经过多次验证有40个基因在连作浸提液培养的无菌苗中表达量变化与DGE结果一致,其中27个基因差异显著。为更加准确锁定地黄连作特异应答基因,我们利用化感物质关键组分阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸分别处理无菌苗,进一步分析在连作土壤浸提液中表达发生显著变化的27个候选基因。结果显示,部分基因在酚酸处理下的表达水平相较于连作土壤浸提液发生了更加剧烈的波动,最终我们锁定10个基因参与地黄连作障碍应答,其中包括1个上调表达(CL2915.Contig2_All),9 个下调表达(Unigene32191_All、Unigene35559_All、Unigene29667_All、CL9586.Contigl_All、Unigene27064_All、Unigene35815_All、Unigene34664_All、Unigene18880_All、Unigene24_All),为进一步研究连作特异响应基因的功能奠定了基础。2.地黄根部特异响应连作障碍miRNAs鉴定及沉默转化植株创制。A.候选miRNAs鉴定。根据前期筛选到的头茬、连作表达显著差异的21个miRNAs,利用qRT-PCR定量鉴定,并准确锁定9个特异响应连作障碍的miRNAs,其中包含7个上调表达 miRNAs,(miR1074、miR530a、miR319d-5p.1、miR5054、miR1520d、miR2592、miR3951),2个下调表达(miR156a、miR167a)。根据报道,上述部分miRNAs参与胁迫及生长激素信号应答,其中miR5054在甘蔗丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和植物激素信号传导途径发挥作用。B.地黄遗传转化体系的建立。经过对比分析,获得如下稳定的地黄遗传转化条件:①以地黄叶片作为外植体进行农杆菌侵染并诱导愈伤效果明显优于块根;②6-BA(1.5mg/L)+NAA(O.1mg/L)的MS基础培养基愈伤组织诱导率最高,而6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)的MS基础培养基分化效率最高;③农杆菌侵染浓度在OD 0.7-0.8,特美汀浓度在100mg/L时农杆菌污染率较低,且不影响愈伤组织正常分化;④Basta筛选浓度为0.2mg/L为最佳筛选强度。C.miR5054沉默转化植株创制。根据定量锁定的连作关键miRNAs,构建STTM miRNA沉默载体,通过叶盘转化法成功获得miR5054阳性转化植株,对转化植株的定量检测证实,miR5054表达呈现显著下调。稳定的地黄遗传转化体系的建立,为后续深入鉴定分析地黄连作障碍响应miRNAs以及相关基因的功能奠定了坚实的基础。