诱导子诱导酪氨酸氨基转移酶基因表达对彩叶草迷迭香酸合成的影响

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:blueblacktzb
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植物次生代谢产物具有多种重要的生物学功能,为人类提供了丰富的药物、香料和工业原料,对人类的生产和生活有着重要影响。植物次生代谢产物的种类繁多,结构迥异,从化学结构上通常归为萜类化合物、酚类化合物和含氮化合物3个主要类群。彩叶草(Coleus blumei)亦名斑叶洋紫苏、锦紫苏,归唇形科鞘蕊花属,是有着黄红紫等各种色彩的柔嫩观叶草本或亚灌木花卉,在印度、印尼、墨西哥等地被视作药用植物。研究发现彩叶草中的主要次生代谢产物为迷迭香酸。迷迭香酸(Rosmarinicacid)是一种多酚羟基酸,具有抗氧化及清除自由基作用,并具有消炎、免疫调节、抗菌、抗病毒、抗抑郁等生物活性。外源茉莉酸甲酯(MJ)作为一种重要的信号分子,能够诱导植物防御的细胞内信号转导途径从而诱导了植物次级代谢的途径。脱落酸(ABA)也是一种十分重要的信号分子,在植物面对来自生物和非生物胁迫时,可以通过应激反应改变许多基因的表达。本文主要从彩叶草中克隆了酪氨酸代谢途径的关键酶酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)基因,研究彩叶草叶片经MJ和ABA诱导后TAT基因在转录表达水平及TAT酶活力变化情况,并考察了不同品种不同组织中TAT的酶活力及其对迷迭香酸含量的影响。具体结果如下:1.利用HPLC对迷迭香酸在不同品种彩叶草(K1,K2,K3)根、茎、叶中的分布进行了检测。通过多次实验得出HPLC检测条件如下:柱子:C18柱150×4.6mm;流动相:甲醇:0.1%磷酸45:55;流速:0.9mL/分钟;检测波长:325nm。我们从三个彩叶草品种中筛选得到迷迭香酸含量较高的品种K2迷迭香酸含量达到1.56 mg/g。彩叶草不同品种、组织中迷迭香酸含量存在明显差异,三个品种中叶片均有较高的迷迭香酸含量,而根、茎组织中迷迭香酸含量较低。2.建立合适的TAT活力测定方法,测定不同品种不同组织TAT活力。结果表明:彩叶草不同品种、组织TAT酶活力存在明显差异。其中K2叶片中TAT酶活力最高,达到44.29 Umg-1h-1。彩叶草不同品种不同组织中TAT酶活力较高的,迷迭香酸含量也相对较高。由此猜测:TAT可能与迷迭香酸的含量呈正相关性;TAT可能在彩叶草迷迭香酸合成途径中起着非常重要的作用。3.利用半定量RT-PCR对TAT基因在彩叶草不同品种不同组织及诱导条件下的表达情况与迷迭香酸合成量的关系进行了初步的探索。研究发现,三个彩叶草品种,TAT基因表达量从高到低依次为K2,K1,K3。K2和K1两个品种叶片中的迷迭香酸含量较高,K3次之。TAT基因在彩叶草根茎叶中为组成型表达,其中茎段TAT基因表达量最高,叶片次之,根中最少。在彩叶草三个品种均表现为叶片含有较高的迷迭香酸含量,根、茎中迷迭香酸含量较低。RA含量并不总是与TAT mRNA的表达水平相关。MJ和ABA都可以诱导彩叶草叶片TAT基因的表达,于是我们推测TAT基因可能可以和信号分子相互作用。4.MJ和ABA的浓度均与彩叶草叶片的TAT活力相关。MJ浓度在0-500μM的范围内,叶片的TAT活力是随着喷施的浓度升高而升高的,但是喷施浓度为600μM时,TAT活力略有下降。说明MJ能够提高彩叶草叶片的TAT活性,但是这种诱导效应是在一定的浓度范围内的,浓度过高的MJ会丧失这种促进作用。不同浓度的ABA喷施彩叶草叶片后,叶片TAT活力先是升高,然后降低。其中50μM ABA处理时TAT活力最高,达到82.80 Umg-1h-1。5.观察外源500μM MJ和50μM ABA对彩叶草叶片中的TAT活力的动态影响发现:用500μM MJ喷施彩叶草叶片后,TAT活力随着时间的延长而逐渐增强,在72小时酶活力达到最高92.85 Umg-1h-1,然后酶活力逐渐降低。经过ABA处理后,彩叶草叶片TAT酶活力也有较大幅度的提高。与MJ相比,ABA作用效果不如MJ对酶活力的影响明显,但是ABA对彩叶草中TAT活力的影响起效更快。6.为了弄清楚彩叶草叶片中TAT活力与迷迭香酸生物合成的关系,利用HPLC法测定了诱导子处理后迷迭香酸含量。结果发现:彩叶草叶片经过MJ喷施处理后,迷迭香酸含量逐渐升高,72小时后,迷迭香酸含量达到3.92 mg/g。彩叶草叶片经过ABA处理48小时后,迷迭香酸含量达到2.81 mg/g,是对照组的2.1倍。这个结果说明,MJ和ABA可以诱导迷迭香酸的生物合成,并且与ABA相比,MJ对迷迭香酸含量的影响更大。
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