本实验建立了用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术体外扩增哺乳动物SRY特异序列鉴别哺乳动物胚胎性别的方法。依据牛、山羊、兔、猪等哺乳动物Sry基因高度同源性设计一对SRY引物，两条引物均为22个碱基，对公牛的SRY特异的163bp序列进行体外扩增。从公、母牛的组织或血液提取基因组DNA，用作PCR扩增基因组DNA的模板，同时在立体显微镜下收集羊-兔异种克隆胚胎，先用0.145mol／L NaCl冲洗2次，再移入20μL胚胎处理液中（10mmol／L Tris-HCl pH8.3，50mmol／L KCl，2mmol／L MgCl₂，0.45％NP-40，0.45％Tween-20，0.1μg／μL蛋白酶K），将羊-兔异种克隆胚胎及其处理液在55℃水浴作用60min，然后将此胚胎溶解物直接作为PCR扩增胚胎DNA的模板。按照析因设计，建立最适PCR扩增牛基因组DNA和羊-兔异种克隆胚胎DNA条件：反应体系中加入无MgCl₂的缓冲液和3×2×3因子组合浓度的SRY引物（每种引物浓度分别为：0.1μmol／L，0.3μmol／L，0.5μmol／L），dNTPs（浓度分别为：0.1mmol／L，0.2mmol／L）和MgCl₂（浓度分别为：0.75mmol／L，1.5mmol／L，2.25mmol／L）；模板为公牛基因组DNA（2μL约100ng）或羊-兔异种克隆胚胎溶解物20μL；2IU Taq DNA聚合酶。反应体系为50μL。反应在微机控制Flexigene型PCR仪上进行，反应参数为：95℃预变性5min后，按95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行30或35个循环后，72℃延伸9min，于4℃结束反应。扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，用PCR Marker作分子量标准，紫外灯下观察，最适PCR反应条件为扩增出最强的SRY产物带而无非特异性扩增带出现时的反应条件。结果表明：SRY引物扩增牛基因组DNA时，PCR最适条件为：0.1μmol／L SRY引物，0.1mmol／L dNTPs和1.5mmol／LMg²⁺，退火温度为58℃，循环次数30次；SRY引物扩增胚胎DNA时，PCR扩增最适条件为：0.5μmol／L SRY引物，0.1mmol／L dNTPs和1.5mmol／L Mg²⁺，退火温度为58℃，循环次数35次。 采用PCR扩增牛基因组DNA最适条件分别扩增了黑白花奶牛9头（6，3）、皖北黄牛11头（3，8）、波尔三羊3只（2，1）、兔4只（1，3）和猪7头（3，4）的基因组DNA。所有雄性样品中均出现清晰可见的特异DNA扩增带，而雌性样品和空白对照中无扩增片段出现。同时采用PCR扩增羊-兔异种克隆胚胎DNA最适条件扩增了15个羊-兔异种克隆胚胎DNA（4个胚胎的供体为公羊，11个胚胎的供体为母羊），所有以公羊为供体的羊-兔异种克隆胚胎样品均出现清晰可见的特异DNA扩增条带，而以母羊为供体的羊－兔异种克隆胚胎样品和空白对照中无扩增片段出现。结果表明PCR法可以用来鉴别哺乳动物的性别以及鉴别哺乳动物胚胎的性别，而且用此法鉴定哺乳动物早期胚胎性别具有相对简单、快速、费用低和准确率高等优点。 本实验还采用设计的性别鉴定引物，按照最优PCR扩增胚胎DNA条件配制了PCR性别鉴定试剂盒。经实验该性别鉴定试剂盒使用准确性高，可降低污染，方法简便易行，成本低，在生产实践中有很大的实用价值。