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细胞凋亡也称细胞程序性死亡,是细胞主动性地清除无用的、受损的以及有害的细胞的过程。近年来的研究显示,化疗药物能够诱导各种肿瘤细胞产生细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长与增殖。研究发现DNA甲基化转移酶(DNMTs)在各种肿瘤中表达异常并且抑制DNMT1的表达具有促凋亡作用。推测在化疗药物治疗肺癌过程中,DNMTs的表达将受到调控,从而影响肿瘤细胞的生长与增殖,进而最终影响临床肺癌的治疗以及预后。研究目的:研究化疗药物顺铂在肺癌细胞凋亡中的作用;检测DNMT1的表达与化疗药物顺铂诱导的肺癌细胞凋亡的关系;阐明DNMT1在化疗药物顺铂诱导的肺癌细胞凋亡中的调控机制;揭示DNMT1以及MAPKs通路在肺癌发生发展中潜在的作用;研究DNMT1以及MAPKs通路在顺铂诱导的细胞凋亡中对CDKN1A的表达调控;探讨DNMT1以及MAPKs通路通过DNA甲基化调控CDKN1A的表达。研究方法:1)不同浓度的顺铂处理肺癌细胞系SKMES-1和H520细胞,CCK8实验检测SKMES-1和H520细胞的活力变化;小室(Transwell)迁移实验检测SKMES-1和H520细胞的迁移能力变化;TUNEL实验检测SKMES-1和H520细胞凋亡程度;蛋白免疫印迹实验检测SKMES-1和H520中凋亡标记基因剪切型Caspase-3的表达情况。2)不同浓度的顺铂处理SKMES-1和H520细胞,蛋白免疫印迹实验检测SKMES-1和H520细胞中DNMT1,DNMT 3A以及DNMT 3B的表达情况。3)构建DNMT1的过表达质粒,肺癌细胞系SKMES-1和H520中转染DNMT1的过表达质粒,然后通过实时定量PCR实验与蛋白免疫印迹实验检测DNMT1的表达情况;经化疗药物顺铂处理的肺癌细胞系SKMES-1和H520中转染DNMT1的过表达质粒,然后通过CCK8实验检测SKMES-1和H520细胞的活力变化;小室(Transwell)迁移实验检测SKMES-1和H520细胞的迁移能力变化;蛋白免疫印迹实验检测SKMES-1和H520细胞的凋亡变化。4)不同浓度的顺铂处理肺癌细胞系SKMES-1和H520细胞,蛋白免疫印迹实验检测SKMES-1和H520细胞中MAPKs通路中三个亚家族:JNK,ERK和p38以及它们相应的磷酸化蛋白的表达水平;诱导细胞凋亡后,分别添加JNK,ERK和p38的磷酸化蛋白的抑制剂,蛋白免疫印迹实验检测SKMES-1和H520细胞中DNMT1以及MAPKs通路中三个亚家族:JNK,ERK和p38的磷酸化蛋白的表达水平。5)诱导细胞凋亡后,分别添加JNK,ERK和p38的磷酸化蛋白的抑制剂,CCK8实验检测SKMES-1和H520细胞的活力变化;小室(Transwell)迁移实验检测SKMES-1和H520细胞的迁移能力变化;TUNEL实验检测SKMES-1和H520细胞凋亡程度。6)顺铂诱导细胞凋亡后,qPCR和蛋白免疫印迹实验检测CDKN1A的表达水平;添加DNMT1抑制剂AZA后,qPCR和蛋白免疫印迹实验检测CDKN1A的表达水平;过表达DNMT1后,qPCR和蛋白免疫印迹实验检测CDKN1A的表达水平;用顺铂处理过表达DNMT1后的肺癌细胞,qPCR和蛋白免疫印迹实验检测CDKN1A的表达水平;用顺铂处理过表达DNMT1后的肺癌细胞,亚硫酸盐测序实验检测CDKN1A启动子区的甲基化水平。7)诱导细胞凋亡后,分别添加JNK,ERK和p38的磷酸化蛋白的抑制剂,qPCR和蛋白免疫印迹实验检测DNMT1以及CDKN1A的表达水平。8)使用免疫组化技术检测15例肺癌患者组织样本以及相应的癌旁健康组织中CDKN1A、DNMT1以及MAPKs通路中三个亚家族:JNK,ERK和p38的磷酸化蛋白的表达水平。研究结果:1)化疗药物顺铂抑制SKMES-1和H520细胞的活力,抑制细胞的迁移能力,化疗药物顺铂能够诱导SKMES-1和H520细胞产生凋亡,促进SKMES-1和H520中凋亡标记基因剪切型Caspase-3的表达。2)化疗药物顺铂抑制SKMES-1和H520细胞中DNMT1的表达,而不影响DNMT3A以及DNMT3B的表达情况。3)DNMT1的过表达质粒能够在肺癌细胞系SKMES-1和H520中过表达DNMT1;过表达DNMT1抑制化疗药物顺铂对SKMES-1和H520细胞的活力的抑制,并抑制化疗药物顺铂对SKMES-1和H520细胞迁移能力的抑制;还能够有效抑制化疗药物顺铂对SKMES-1和H520细胞凋亡的抑制。4)化疗药物顺铂促进SKMES-1和H520细胞中MAPKs通路中三个亚家族:JNK,ERK和p38的磷酸化蛋白的表达水平;在诱导SKMES-1和H520细胞凋亡后,添加磷酸化JNK的抑制剂SD100625能够有效抑制磷酸化JNK的表达,并且抑制JNK蛋白的磷酸化能够回复DNMT1的表达;而加磷酸化ERK的抑制剂PD98059能够有效抑制磷酸化ERK的表达,并且抑制ERK蛋白的磷酸化能够回复DNMT1的表达;磷酸化p38的抑制剂SB203580能够有效抑制磷酸化p38的表达,并且抑制p38蛋白的磷酸化能够回复DNMT1的表达。5)诱导细胞凋亡后,磷酸化JNK的抑制剂SD100625、磷酸化ERK的抑制剂PD98059以及磷酸化p38的抑制剂SB203580能够抑制顺铂对细胞活力的抑制,抑制顺铂对细胞迁移能力的抑制并能够抑制顺铂诱导细胞凋亡的能力。6)化疗药物顺铂促进SKMES-1和H520细胞中CDKN1A的表达;DNMT1抑制剂AZA促进SKMES-1和H520细胞中CDKN1A的表达;过表达DNMT1抑制SKMES-1和H520细胞中CDKN1A的表达;过表达DNMT1抑制SKMES-1和H520细胞中顺铂对CDKN1A的表达调控;顺铂降低SKMES-1和H520细胞中CDKN1A启动子区的甲基化水平,而过表达DNMT1能够抑制顺铂对CDKN1A启动子区的甲基化水平的调控作用。7)MAPKs抑制剂能够抑制肺癌细胞SKMES-1和H520细胞中化疗药物顺铂对CDKN1A和DNMT1的表达调控。8)在15例肺癌患者中,有11例患者的CDKN1A在癌旁组织中的表达水平比相应的癌组织中高,有11例患者的DNMT1在癌旁组织中的表达水平比相应的癌组织中低,有11例患者的磷酸化JNK蛋白在癌旁组织中的表达水平比相应的癌组织中高,有11例患者的磷酸化ERK蛋白在癌旁组织中的表达水平比相应的癌组织中高,有11例患者的磷酸化p38蛋白在癌旁组织中的表达水平比相应的癌组织中高。结论:本研究表明化疗药物顺铂诱导肺癌细胞产生细胞凋亡;化疗药物顺铂抑制肺癌细胞中DNMT1的表达;过表达DNMT1抑制化疗药物顺铂的作用;MAPKs参与细胞凋亡中DNMT1的表达调控;顺铂促进肺癌细胞中CDKN1A的表达;DNMT1抑制CDKN1A的表达;顺铂诱导的细胞凋亡过程中,DNMT1通过影响CDKN1A启动子区的甲基化水平来调控CDKN1A的表达;顺铂诱导的细胞凋亡过程中,MAPKs通路的抑制剂抑制顺铂诱导的CDKN1A上调表达;临床肺癌患者中,CDKN1A、DNMT1以及MAPKs通路各组分的磷酸化蛋白的表达异常。