研究背景：系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多因素参与、以自身抗体产生和免疫复合物沉积及多系统损害为特征的自身免疫性疾病。SLE的发病机制长期以来就是风湿免疫研究领域的难点。因此研究SLE的发病机制、寻找有效的治疗措施,对于改善患者生存质量,具有十分重要的意义。免疫调节异常在SLE的发病过程中起着主导作用,其中包括免疫细胞功能异常。细胞因子是指由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激后合成、分泌的一类生物活性物质。作为细胞间信号传递分子,主要介导和调节免疫应答及炎症反应,刺激造血功能,并参与组织修复等。SLE患者体内存在多种细胞因子表达异常,其发病过程中存在明显的细胞因子网络失调,细胞因子谱偏移。随着近些年来分子生物学技术的发展,发现SLE疾病的发生和发展过程中致炎细胞因子和抗炎细胞因子之间失衡程度决定了病情的严重性和范围。高迁移率族蛋白1(high mobility group protein box 1, HMGB1)是一种参与细胞核内多种生物学功能的核内蛋白,最新的研究发现它是一种新型的炎性细胞因子。近年研究发现,HMGB1可以在胞浆、胞膜上表达,也能被分泌到细胞外。单核巨嗜细胞在受到炎性刺激(LPS、TNFa、IL-1等)后,能够主动使位于核内的HMGB1转移至胞浆,并通过蛋白质非经典分泌途径将其分泌到细胞外。另外坏死细胞也可以被动释放HMGB1。核外的HMGB1是一种急慢性炎症的前炎症因子,能刺激血管内皮细胞、单核巨嗜细胞分泌炎性细胞因子和黏附分子,招募炎症细胞至损伤部位,诱导大量细胞因子的分泌,介导多种急慢性炎症性疾病,如感染性休克、急性肺损伤、心血管疾病和风湿免疫性疾病等,同时HMGB1还是一种内源性的免疫辅剂,是树突状细胞成熟和Th1细胞极化过程中的一个调节因子,HMGB1在细胞外可诱导TNF-a、IL-1、IL-6及多种粘附分子如VCAM-1和MCP-1的表达,同时HMGB1对于维持Th1/Th2细胞因子之间的平衡也有着重要作用。以往的研究已经证实,HMGB1和多种自身免疫性疾病相关,并已成为关节炎治疗的靶标。但其在SLE发病过程中是否起作用及其可能的作用机制尚不清楚,有关HMGB1与SLE的发病关系国外虽已有少量研究报道,但研究结果不尽相同。因此,本研究拟从临床病例资料和实验室检测两个方面,采用目前比较成熟的ELISA方法检测患者血浆中含](?)MGB1的水平,及血浆中HMGB1浓度与SLE疾病活动的相关指标之间的的相关分析,研究HMGB1在SLE发病中的作用,并通过观察PBMCs中HMGB1-mRNA基因的表达变化,探讨HMGB1在SLE疾病中可能的作用机制,为SLE的治疗提供新的治疗策略和实验依据。目的：1.通过检测SLE患者血浆HMGB1水平及其外周血单个核细胞中HMGB1-mRNA的表达情况,探讨HMGB1在SLE疾病中可能的作用机制。2.通过分析SLE患者血浆HMGB1水平和外周血单个核细胞中](?)MGB1-mRNA的表达水平与SLEDAI及其它一些病情活动指标的相关性,探讨HMGB1与SLE疾病活动的关联,为判断SLE的预后提供理论依据、同时为SLE的治疗提供新的治疗策略。方法：1、病人特征选取南方医科大学附属南方医院皮肤风湿科门诊及住院SLE患者44例,均符合1997年美国风湿病协会(American College of Rheumatology, ACR)修订的关于SLE的分类诊断标准。其中SLE活动组26例,SLE稳定组18例,与上述44例患者性别年龄相匹配的健康志愿者18例作为正常对照组。所有入组人群均无吸烟史及合并肿瘤和感染性疾病,以上患者和志愿者均征得本人同意并签订了知情同意书。所有患者均检测血常规,肝、肾功能,自身抗体,体液免疫,CRP, ESR, IgG,24小时尿蛋白,同时记录相应的临床和实验室指标。2、HMGB1在系统性红斑狼疮患者外周血中的表达水平检测取上述44例SLE患者及18例健康志愿者人群的空腹外周血血浆采用酶联免疫吸附法(Enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中HMGB1的浓度。操作程序总结如下：①加样品和标准品,再加生物素标记抗体,37℃反应,60min；②洗涤液洗涤4次；③加亲和链酶素-HRP,37℃温育30min；④洗涤液洗涤4次；⑤加底物A和B,37℃温育10min；⑥加终止液,用酶标仪450nm读数。3、系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中HMGB1 mRNA的表达情况检测选取上述44例SLE患者及18例健康志愿者人群的空腹静脉外周血10ml,采用反转录-多聚酶链反应(reverse transcriptase-polymerse chain reaction, RT-PCR)检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中HMGB1mRNA的表达情况。RT-PCR操作程序如下：①利用梯度密度分离法分离外周血中的单个核细胞,加TRIZOL裂解细胞：②TRIZOL法提取单个核细胞中总RNA；③凝胶电泳观察RNA的完整性,紫外分光光度计检测RNA浓度；④根据genebankHMGB1基因序列采用primer5.0设计合成HMGB1、β-actin引物序列；⑤利用提取的总RNA合成cDNA模板；⑥cDNA为模板,HMGB1、β-actin引物进行序列扩增；⑦凝胶电泳,用凝胶成像分析系统进行灰度扫描,结果以HMGB1/β-actin灰度比之表示；⑧PCR产物基因测序。4、统计学处理：所有数据输入SPSS13.0软件包,两组样本均数之间的比较使用两独立样本t检验,多组样本之间均数之间的比较,当满足方差齐性时,使用单向方差分析(One-way ANOVA)和样本均数之间的多重比较(LSD法)；当不满足方差齐性时,使用近似F检验(Welch法)和校正的多重比较方法(Dunnett’s T3法)；双变量间的关系使用双变量相关分析；使用Curve Estimation绘制拟合曲线并根据曲线拟合的决定系数R2选择最佳曲线拟合方程；选取a=0.05作为检验水准,结果中数据以x±SD。结果：(1)活动期SLE患者组血浆HMGB1水平(363.44±302.226ng/ml)明显高于正常对照组(110.178±100.078ng/ml) (P<0.01)和非活动期SLE患者组(142.75±153.811 ng/m1)(P<0.05)；非活动期SLE患者组和正常对照组之间差异无统计学意义。(2)活动期SLE患者组HMGB1 mRNA相对表达量(3.493±2.825)高于非活动期SLE患者组(1.785±0.735)(P<0.01)和正常对照组(1.179±0.792)(P<0.05),而非活动期SLE患者组HMGB1 mRNA相对表达量与正常对照组相比无显著性差异。(3)SLE患者组血浆中HMGB1水平与SLEDAI、ESR、C3、ds-DNA、24小时尿蛋白等呈正相关；血浆中HMGB1蛋白表达水平与C4、ALB呈负相关。SLE患者PBMC中HMGB1-mRNA的表达与SLEDAI及血浆HMGB1水平呈正相关。结论：1.我们的结果表明HMGB1可能并未参与SLE的早期发病过程,但当疾病发展到一定的程度,HMGB1分泌增高,可能在本病的进一步发展中起重要作用,提示HMGB1是SLE发病过程中重要的促炎性细胞因子之一,可能成为判断SLE临床病情变化敏感指标之一。2.我们进一步使用RT-PCR方法检测了44例SLE患者及18例正常对照组PBMCs中HMGB1-mRNA的表达水平,从基因水平证实了我们上述的研究发现,提示HMGB1在SLE的病情发展中起重要作用,血浆HMGB1水平及HMGB1-mRNA表达水平均可用作判断SLE病情活动及严重程度的指标。3.推测HMGB1在SLE中的免疫作用可能是通过前期炎症因子与患者PBMC表面的受体结合后,激发某种跨膜信号传导途径将信号传入细胞核,引起目的基因HMGB1的表达,从而主动合成、分泌HMGB1,使患者外周血血浆中HMGB1表达水平明显升高,进一步使细胞因子网络紊乱而致病。干预HMGB1的活性有可能成为新的SLE治疗策略。随着对HMGB1信号转导通路作用机制的进一步阐明,以HMGB1为靶点的药物有望成为治疗SLE的新的治疗途径。综上所述,本实验从临床病例资料和实验室检测两个方面进行研究,结果显示：HMGB1在SLE发病机制中发挥着重要的作用,是SLE治疗中又一个值得关注的新的分子治疗靶点。但是,本研究仅就其在SLE患者外周血血浆及单个核细胞中的表达进行了初步探讨,还需借助于实验动物模型对其作用通路进行深入的研究和探讨。