研究背景大面积皮肤缺损是整形外科面临的一大难题,皮肤软组织扩张术已成为继皮片移植和皮瓣转移技术之后整形外科常用的治疗方法之一,常被应用于组织缺损的修复。其优点在于可以提供较充足的与缺损皮肤相匹配的“额外”皮肤,获得更为理想的修复效果。但皮肤扩张存在周期长、效率低和并发症发生率较高等问题,影响了该项技术的发展。探索适宜的方法促进扩张皮肤的新生、提高皮肤扩张的效率,才能更好地解决上述临床问题。干细胞因其可塑性强,在各类疾病治疗和创伤修复中越来越受到重视。近几年,有研究者尝试将脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞应用于扩张皮肤,发现干细胞移植可以显著促进扩张皮肤的新生,提高扩张效率。毛囊干细胞（HFSC）是位于毛囊隆突部的干细胞,不仅能调控毛囊毛发的生长周期,还参与皮肤的创伤修复。相对于上述两类干细胞,HFSC位于毛囊内,与上皮细胞、真皮细胞相互作用,与皮肤的关系更为密切。另外,人类的HFSC可以通过拔取头发获得,这种获取方法较其它干细胞更为简便和安全。已有研究者将HFSC局部注射到创面,证实HFSC移植可促进皮肤的损伤修复。皮肤软组织扩张本质上类似于反复的微创伤及组织修复过程,但HFSC移植是否可以促进扩张皮肤的新生还未有研究报道。在本研究中我们将绿色荧光蛋白（GFP）转基因SD大鼠的HFSC局部注射在扩张皮瓣中,观察皮瓣的相关指标变化,评估移植HFSC对扩张皮肤新生的作用;对移植的干细胞进行定位追踪,明确HFSC的分化情况;检测扩张皮肤多种生长因子的表达,探索HFSC促进皮肤新生的相关机制。由于研究者和临床医生的广泛关注,目前关于HFSC已开展了大量的动物实验。根据之前的报道,有些研究使用的乳鼠来源的HFSC,而有些研究使用的成年大鼠来源的HFSC。然而,HFSC的特性是否具有年龄相关性?哪个年龄来源的HFSC更适合于细胞培养扩增,更适合应用于干细胞替代治疗?据我们所知,目前尚无关于上述问题的相关报道。了解不同年龄段HFSC的生物学特性,可以为干细胞研究和治疗的供体年龄选择提供实验参考。我们拟以乳鼠和成年大鼠来源的HFSC为模型,研究年龄对干细胞的形态、表面抗原表达、增殖活力、多向分化潜能和可持续扩增性等重要特性的影响。研究目的研究HFSC移植对扩张皮肤新生的影响,并探索其作用机制,为进一步开发新的促进皮肤扩张的方法奠定实验基础;研究不同年龄段HFSC的生物学特性的差异,分析其可能的生物学意义,为HFSC研究中的细胞来源的选取提供实验依据,也为如何选择合适的干细胞治疗供体年龄提供建议。研究方法本研究一共分为四部分。1)采用显微解剖结合酶消化的方法,分离并培养GFP转基因SD大鼠乳鼠的触须部HFSC,使用无血清的DK-SFM培养基和胰酶抑制剂来降低血清对HFSC分化的影响。观察并记录培养过程中的细胞形态特征。对第三代细胞分别使用CD34和整合素β1流式细胞术、CK15免疫荧光、成脂诱导分化及油红O染色的方法进行鉴定。2)以乳鼠和成年大鼠来源的HFSC为模型,比较两组HFSC的形态、直径、表面标记物、分化潜能、死亡率、生长曲线、增殖活力,研究年龄对HFSC特性的影响。3)利用1 mL圆形特制扩张器,建立大鼠头部扩张模型,并在头顶部标记1cm×1cm的正方形文身。扩张器埋置7天后,将来自GFP转基因大鼠分离培养的HFSC（GFP-HFSC）局部注射到扩张皮肤。次日起开始对扩张器进行注水扩张,每次1 mL,每周3次。在第7天和28天时分别取材,对相关指标进行对比分析。分析的指标主要分为三个部分:第一部分为扩张后皮肤的面积、重量、回缩率、表皮和真皮的厚度、胶原含量、增殖细胞数量、血流和新生血管;第二部分为移植的GFP-HFSC在扩张皮肤中的定位及其分化的细胞类型;第三部分为扩张皮肤的生长因子表达量,包括EGF、TGF-β、bFGF和VEGF。4)收集培养48h的HFSC条件培养基（HFSC-CM）,通过ELISA法检测培养基中与成纤维细胞相关的生长因子的表达量。将HFSC-CM体外作用于大鼠皮肤成纤维细胞,通过划痕实验和CCK-8法,观察HFSC分泌的生长因子对成纤维细胞的迁移能力及增殖活力的影响,并通过Real-time PCR法检测成纤维细胞分泌的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达量变化。研究结果1)通过显微解剖结合酶消化的方法,简便、高效地培养出HFSC,培养的细胞在荧光显微镜下呈现出绿色荧光,表现出干细胞的典型特性:细胞小、呈鹅卵石样、核大、巢状、立体、高折射率、高集落形成能力,在这些细胞中偶见有丝分裂象,显示出体外增殖的潜能。通过成脂诱导分化实验和油红O染色,验证了该细胞具有向成脂分化的潜能。细胞免疫荧光染色结果显示细胞CK15为阳性,应用流式细胞术检测发现,细胞表面高表达标记物CD34和整合素β1。2)乳鼠和成年大鼠HFSC都表现出干细胞的典型特征。通过图像对细胞大小进行比较,乳鼠HFSC较成年大鼠HFSC小。使用自动细胞计数仪对两种HFSC直径进行量化比较,发现在同一代次,乳鼠HFSC的直径小于成年大鼠HFSC（p＜0.05）。通过重复测量方差分析得出,乳鼠HFSC的直径在P0、P1、P3和P5代次间没有差异（p＞0.05）,而成年大鼠HFSC的直径在P0、P1、P3和P5代次间有增加的趋势（p＜0.05）。流式细胞术和细胞免疫荧光检测结果提示,乳鼠和成年大鼠HFSC的表面抗原表达无差异（p＞0.05）。成脂诱导分化及油红O染色结果显示,乳鼠HFSC分化能力强于成年大鼠HFSC（p＜0.05）。乳鼠HFSC的死亡率在P0代和P1代低于成年大鼠HFSC（p＜0.05）,而在P3代和P5代,乳鼠和成年大鼠HFSC的死亡率无统计学差异（p＞0.05）。在同一时间点,乳鼠活细胞数量显著多于成年大鼠。CCK8法检测结果显示,在所有观察时间点,乳鼠HFSC较成年大鼠都表现出更强的增殖活力（p＜0.01）。3)将HFSC局部注射在大鼠头部扩张皮肤,发现HFSC移植使扩张皮肤文身区域面积增大（p＜0.01）,重量增加（p＜0.01）,回缩率降低（p＜0.01）;HE染色结果显示,干细胞移植后扩张皮瓣的表皮和真皮厚度增加（p＜0.01）;Masson染色和Real-time PCR结果表明,HFSC组较对照组胶原排列更紧密,表达量更高（p＜0.01）;PCNA免疫组化染色观察发现,移植的HFSC使扩张皮瓣细胞增殖更为显著（p＜0.01）,阳性表达细胞大部分分布在毛囊周围及表皮基底层;激光血流灌注成像仪检测发现,HFSC移植增加了扩张皮肤的微循环血量（p＜0.01）;CD31免疫荧光染色结果提示,HFSC组的血管数量显著高于对照组（p＜0.01）。对移植的GFP-HFSC示踪,免疫荧光双标染色结果发现:在扩张皮肤血管中可见GFP+/CD31+细胞,提示移植的HFSC分化为血管内皮细胞,参与新血管的生成;在表皮层可见GFP+/CK10+细胞,提示移植的HFSC可分化为角质形成细胞,参与表皮的生成;在毛囊周围观察到GFP+/CK14+细胞,提示移植的HFSC分化为毛囊外根鞘细胞,参与毛囊的生长。然而,HFSC组的扩张皮瓣中并未发现GFP+/Vimentin+细胞,提示移植的HFSC并未通过直接分化的方式参与成纤维细胞的新生。通过Western Blot以及Real-time PCR法检测扩张皮瓣的生长因子表达量,发现移植的HFSC提高了 EGF、VEGF、bFGF和TGF-β的蛋白和mRNA水平的表达。4)收集培养48h的HFSC-CM,ELISA法检测发现培养基中含有EGF、bFGF和TGF-β。划痕实验发现,经HFSC-CM处理过的成纤维细胞的迁移能力高于未经处理的细胞（p＜0.01）,且HFSC-CM浓度为50%时为最佳处理浓度。CCK-8法检测结果提示,经HFSC-CM浓度为50%和75%的培养基处理过的成纤维细胞,其增殖活力高于未处理组及低浓度HFSC-CM（10%和25%）处理组。同时,Real-time PCR检测结果证实,经50%浓度HFSC-CM处理后的成纤维细胞的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达均显著提高（p＜0.01）。研究结论1)我们通过显微解剖结合酶消化方法,成功分离培养出易于扩增且具有良好活性的HFSC。2)通过对乳鼠和成年大鼠HFSC的对比,发现HFSC的特性具有年龄相关性,乳鼠来源的HFSC更适合培养与扩增,更适用于HFSC促进扩张皮肤新生的实验研究。3)通过在体实验,首次证明HFSC移植,可以促进扩张皮肤表皮与真皮的组织细胞新生。其作用机制一方面是通过HFSC直接分化为血管内皮细胞、表皮细胞、毛囊外根鞘细胞参与皮肤的新生;另一方面是通过分泌多种生长因子（包括EGF、VEGF、bFGF、TGF-β）促进扩张皮肤的新生。4)通过体外实验,证明了移植的HFSC可能通过分泌EGF、bFGF、TGF-β等生长因子,提高成纤维细胞的增殖活力、迁移能力及分泌胶原的能力,从而促进扩张皮瓣真皮组织的新生。