论文部分内容阅读
目的:睾丸间质细胞主要分泌雄性激素,睾丸间质细胞受损或受干扰则可导致雄性激素水平异常并影响精子生成。采用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide,dihydrochloride,AAPH)诱导的氧化应激损伤的大鼠睾丸间质细胞系R2C为模型,以四种不同结构花色苷为干预因子,通过体外细胞实验研究花色苷对R2C细胞氧化应激损伤干预作用的构效关系,为不同结构花色苷对雄性睾丸间质细胞损伤干预提供细胞水平层面的理论基础。方法:采用CCK8细胞活性试剂盒测定不同浓度AAPH对细胞活性的影响,再通过放射免疫分析技术(Radioimmunoassay,RIA)对细胞培养液中孕酮含量进行检测,以确定AAPH的作用浓度;以矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucoside,C3G)对AAPH引发氧化应激损伤的R2C细胞保护效果最好的浓度作为四种花色苷的干预浓度。以选定作用浓度的AAPH和选定干预浓度的四种不同结构花色苷作用于细胞,培养液中的孕酮含量以RIA技术进行测定,细胞活性以CCK8试剂盒进行测定,活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)水平变化以免疫荧光技术(Immunofluorescence Assay,IFA)进行分析,线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)下降的细胞变化比例以流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)进行分析,孕酮合成关键蛋白胆固醇跨线粒体膜转运蛋白(Steroidogenic acute regulatory,St AR)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)表达量以蛋白质印迹法Western Blot法进行测定分析。采用高效液相色谱分析法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定不同结构花色苷的降解水平,用DPPH自由基清除法、铁离子还原法(Ferric ion Reducing Antioxidant Power,FRAP)和ABTS自由基清除法测定不同结构花色苷的抗氧化活性。结果:以160μmol/L浓度的AAPH作用于R2C细胞作为损伤模型、以50μmol/L浓度的花色苷作为干预浓度进行试验。在AAPH单独作用24小时后结果显示:细胞培养液中孕酮含量显著下降,细胞内孕酮合成关键蛋白St AR和3β-HSD表达水平显著下调,测定R2C细胞活性与对照组相比统计学分析没有差异;线粒体膜电位MMP损伤率显著上升,0-320 min的细胞ROS测定结果也表明AAPH刺激下细胞内ROS水平显著升高。四组花色苷干预组结果显示:与AAPH单独损伤组相比,细胞孕酮均显著上调,其中仅矢车菊素-3-5-葡萄糖苷干预组细胞内孕酮合成关键蛋白St AR和3β-HSD蛋白相对于AAPH损伤组其表达量同时显著上调,细胞内ROS被有效清除,MMP损伤率显著下降。四种不同结构花色苷对AAPH造成的细胞损伤均有较好保护作用,其中矢车菊素-3-5-葡萄糖苷相对于另外三种花色苷干预后的多项指标更接近于正常对照组。体外花色苷抗氧化活性和稳定性分析显示:50μmol/L浓度的矢车菊素-3-5-葡萄糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷抗氧化能力无显著差异且比另外两种花色苷强,矢车菊素-3-5-葡萄糖苷在培养基中4小时后的降解率最低。结论:R2C细胞氧化应激损伤时,类固醇合成关键蛋白St AR和3β-HSD受到抑制,最终影响其孕酮合成。不同结构花色苷均能够清除细胞内ROS,降低MMP损伤比率,促进St AR和3β-HSD蛋白表达,最终对氧化应激损伤造成R2C孕酮合成下降起到干预作用。花色苷对AAPH造成的R2C细胞氧化损伤保护作用与花色苷本身的抗氧化能力呈正相关。矢车菊素-3-5-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷综合抗氧化活性和对细胞ROS清除作用效果比其它两种更强,其中矢车菊素-3-5-葡萄糖苷的双糖基结构更加稳定而使其在实验模型中发挥更加持久的抗氧化作用,确保其对氧化应激损伤R2C细胞的孕酮合成干预和线粒体损伤抑制的保护效果最佳。