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细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）是表达于T细胞表面的一种抑制T细胞活化的负调节分子,在恶性肿瘤及一些自身免疫疾病的发生发展中发挥重要作用。肿瘤细胞可以利用CTLA-4实现免疫逃逸,CTLA-4的阻断剂如单克隆抗体能够重新激活免疫系统,达到抗肿瘤的目的。本研究旨在利用鼠源及人源抗体库技术获取靶向人CTLA-4的单克隆抗体。合成人CTLA-4胞外区基因,扩增得到胞外区基因片段,插入大肠杆菌表达载体pET28a,构建了编码人CTLA-4胞外区基因的重组质粒pET28a-CTLA4。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosseta（DE3）中,在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、于37℃诱导4 h的条件下,实现了人CTLA-4胞外区重组蛋白的高效表达,表达产物主要为包涵体。对诱导温度、诱导时间及诱导剂IPTG终浓度三个因素进行了优化,确定重组蛋白在IPTG终浓度为1 mmol/L、于25℃诱导6 h的条件下表达量最高。利用高浓度尿素溶解包涵体蛋白,通过Ni2+亲和层析获得了纯度大于90%的重组蛋白。将包涵体蛋白复性成为可溶蛋白,制备了人CTLA-4胞外区基因重组抗原。利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原对5只BALB/c小鼠进行了4次免疫。选取血清效价最高的小鼠分离脾脏,提取总RNA,逆转录成cDNA。以cDNA为模板分别扩增得到大小约300bp的抗体轻、重链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将轻、重链可变区基因拼接成大小约为750bp的单链抗体片段ScFv。将ScFv插入噬菌体载体pCANTAB-5E中,转化至大肠杆菌TG1,经PCR鉴定ScFv插入率约为93.5%,构建了库容量约为1.4×106的鼠源噬菌体单链抗体库。经过3轮富集筛选,获得2株针对人CTLA-4胞外区基因重组抗原的鼠源单链抗体基因。另一方面,利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原,对大容量的人源噬菌体单链抗体库按照“吸附、洗脱、扩增”的顺序反复进行了4轮淘选。第4轮淘选完成后,经ELISA鉴定,获得24株阳性噬菌体克隆。对该24株阳性噬菌体克隆携带的抗体序列进行分析,其中21株噬菌体克隆携带的抗体基因完全一致,重复率达87.5%,提示其为能够与抗原特异性结合的人源单链抗体基因。利用PCR分别扩增得到大小为324 bp的轻链可变区基因和351 bp的重链可变区基因,构建重组质粒pABL-VL和293H-VH,利用共转染293 F细胞,成功表达了具有完整结构的全抗体。经Protein A亲和层析纯化,获得了纯度大于90%的人源单克隆抗体。利用ELISA、Western印迹鉴定,结果表明抗体具有良好的特异性。此外,还制备了针对人突触小体相关蛋白25（SNAP25）的鼠源单克隆抗体。利用大肠杆菌成功表达了SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞。经过两轮筛选获得12株针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,同时鉴定了抗体亚型。选取与抗原结合活性最高的14号杂交瘤细胞株制备腹水单抗,经Protein G亲和层析纯化,最终获得一株纯度大于90%的单克隆抗体,可用于肉毒毒素的检测。