目的：利用ITSFn神经发育毒性评价模型,探究硝酸钇对神经发育影响的可能作用机制,为动物实验观察终点提供细胞学依据。参照OECD426神经发育毒性实验指南,对硝酸钇的神经发育毒性进行安全性评价,并初步探索其可能的毒性机理；丰富硝酸钇的毒理学数据并为确定钇元素的健康指导值提供理论依据。方法：1硝酸钇对ITSFn神经发育毒性评价模型的影响及其机制的研究①采用MTT法,计算硝酸钇染毒原代细胞的IC50;②硝酸钇浓度分为四组,分别为0.55.2.75、13.7v27.5μg/mL,对照组为相应阶段培养基。利用ITSFn神经发育毒性评价模型,对最终诱导得到的高比例神经元进行如下指标检测：应用彗星试验和流式细胞仪检测神经元细胞凋亡率,应用Real Time PCR方法对神经元细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相关基因进行检测；利用免疫印迹和分光光度法测定细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达水平2硝酸钇对大鼠的神经发育毒性的研究2.1硝酸钇神经发育毒性剂量设计①大鼠急性毒性试验：采用霍恩氏(Horn)法,以0,215,464,1000,2150 mg/kgBW剂量的硝酸钇溶液进行大鼠灌胃,灌胃量为10.0mL/(kg·BW),连续观察14天。记录死亡数,查表求得LD50。②单一性别28天喂养试验：以雌性大鼠LDso的1/10,1/20,1/40(80、40、20mg/kg/day)分别作为本试验的高剂量,中剂量和低剂量组,对照组给与等体积的蒸馏水,连续28天,自由饮食。每周记录大鼠体重及进食量,试验结束时,检测大鼠血常规、血生化等指标,进行脏器大体检查并进行组织取材。2.2大鼠的神经发育毒性试验sD雌、雄大鼠按雌雄1：1的比例合笼交配,以发现阴栓的日期作为孕期的第0天。将孕鼠随机分入低、中、高3个实验组和1个对照组,每组20只,单笼饲养,从孕期第6天至分娩后第21天(PND21)每天分别经口灌胃孕鼠剂量为.45mg/kg BW的受试物,对照组灌胃给予相应剂量的蒸馏水。在分娩后第4天,进行窝的标准化,每窝保留4只雄鼠和4只雌鼠。断乳后,处死母鼠,仔鼠(喂饲组)以基础饲料继续喂养至PND70天,另有部分仔鼠(给药组)持续灌胃给予原剂量受试物至PND70天。仔鼠神经发育毒性实验动物分配数目参照OECD426推荐方法。①母鼠观察指标：记录母鼠妊娠期和哺乳期间的体重、剩食量并计算食物利用率,仔鼠断乳时,检测母鼠血常规、血生化指标,组织器官取材,称重测定器官脏器系数,HE染色镜下观察。对未能生产的母鼠进行子宫内着床点的检查。②仔鼠(喂饲组)观察指标：记录仔鼠断乳前和断乳后体重、断乳后进食量并计算食物利用率,记录仔鼠生殖相关指标(仔鼠出生成活率、仔鼠出生个数、出生雄鼠百分比、仔鼠出生体重、仔鼠4天成活率、仔鼠21天成活率)和性成熟指标、检测仔鼠血常规、血生化指标、脏器取材称重并计算器官脏器系数,HE染色镜下观察,脑组织同时进行Nissl染色观察海马DG区锥体细胞数目。检查仔鼠早期神经发育指标(平面翻正反射、悬崖回避、前肢悬挂、听觉惊愕、嗅觉定向、空中翻正反射),并在青春期和成熟早期对仔鼠的感觉功能、运动功能和认知功能进行测试。③仔鼠(给药组)观察指标：记录仔鼠断乳后体重、进食量并计算食物利用率,检测仔鼠血常规、血生化指标、脏器取材称重并计算器官脏器系数,HE染色镜下观察,脑组织同时进行Nissl染色观察海马DG区锥体细胞数目。对成熟早期仔鼠的感觉功能、运动功能和认知功能进行测试。2.3硝酸钇神经发育毒性机制研究取PND21天和给药组PND70天时仔鼠海马,对如下指标进行检测：应用Real Time PCR方法对海马中Bcl-2、Bax、Caspase-3、CaM、CaMK Ⅱ、CREB和BDNF等相关基因进行检测；利用免疫印迹和分光光度法测定海马中Bcl-2、Bax、Caspase-3、CamkⅡ、CREB和BDNF蛋白的表达水平,采用液相色谱-质谱／质谱联用技术检测海马中氨基酸类神经递质含量。结果1硝酸钇对ITSFn神经发育毒性评价模型的影响及其机制的研究①随着暴露浓度的增加,细胞生长抑制率逐渐上升,存在剂量-反应关系,统计计算得硝酸钇IC5o为224.16μg/mL;②彗星试验结果未见氧化损伤,但13.7和27.5μ/mL剂量组调亡细胞数占总细胞数比例与对照组比较显著升高(P<0.05)；流式细胞仪检测结果显示,各受试物组细胞凋亡率呈现先降低后升高的趋势。0.55μg/mL剂量组神经元细胞凋亡率下降,而27.5μg/mL剂量组神经元细胞凋亡率上升,与对照组比较差异均有显著性(P<0.05)；RT-PCR和Western blot结果表明,0.55 μg/mL剂量组上调抗调亡基因Bcl-2的表达,但抑制促调亡基因Bax和Caspase-3的表达,而27.5 μg/mL剂量组则可上调Caspase-3和Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,Bcl-2/Bax比值总体上呈现先上升再下降的趋势。2硝酸钇对大鼠的神经发育毒性及其机制的研究2.1硝酸钇神经发育毒性剂量设计①查表求得雌鼠LD50为794mg/kgBW,根据急性毒性分级属于低毒类物质。②28天一般毒性预实验：40 mg/kg/day剂量组第三、四周体重和总增重低于对照组,80 mg/kg/day剂量组第二、三、四周体重和总增重低于对照组,上述差异均有显著性(p<0.05)。大鼠部分血生化、血常规指标存在显著差异,但均在正常范围内,不认为有生物学意义。2.2大鼠的神经发育毒性试验①母鼠实验结果显示：与对照组相比,硝酸钇对母鼠在妊娠期和哺乳期的体重、进食量及食物利用率的影响不具有统计学差异(p>0.05)。部分血生化、血常规指标存在显著差异,但均在正常范围内,不认为有生物学意义。病理检查未见异常。②喂饲组实验结果显示：妊娠期和哺乳期暴露受试物能够促进雌、雄仔鼠体重的增重。PND21天时,受试物组与对照组相比差异有显著性(p<0.05),不过这种差异会随着受试物暴露结束而消失。未见硝酸钇对仔鼠出生存活率、性别比、每窝出生个数和性成熟等繁殖和生理发育指标、总进食量、总食物利用率和海马DG区Nissl染色阳性的细胞数目产生影响,病理检查未见异常。部分血生化、血常规、脏器系数、早期神经发育和神经行为结果存在显著性差异,但不认为有生物学实际意义。③给药组实验结果显示：从PND42天开始至实验结束,雄性45 mg/kg/day剂量组体重显著低于对照组(p<0.05)。未见硝酸钇对进食量、食物利用率、血生化、血常规和脏器系数产生有实际意义性的改变。一般病理和神经病理检查也未见异常。Morris水迷宫试验中,雌鼠45 mg/kg/day剂量组第5天的潜伏期高于对照组且差异有显著性(p<0.05),其他神经行为试验,均未见受试物组与对照组比较差异有显著性(p>0.05)。2.3硝酸钇神经发育毒性机制研究RT-PCR和Western blot结果表明,硝酸钇分别下调PND21天雄鼠5和15 mg/kg/day剂量组,上调PND21天雌鼠5、45 mg/kg/day剂量组和PND70天时雄鼠15 mg/kg/day剂量组的CaMRNA表达水平,与对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。PND21天时,雄鼠高剂量组γ-氨基丁酸含量和雌鼠甘氨酸含量均高于对照组,差异有显著性(p<0.05)。未见硝酸钇对PND21天和PND70天雌、雄仔鼠海马中凋亡调控相关基因和蛋白、CaMKⅡ CREB和BDNF基因与蛋白的表达水平产生有实际意义性的改变。结论1.首次利用ITSFn模型,对硝酸钇神经发育影响的可能作用机制进行研究。结果表明,硝酸钇对小鼠胚胎干细胞神经发育的影响具有双重性。低浓度的硝酸钇可促进神经元细胞中抗凋亡基因Bc1-2的表达,但抑制促凋亡基因BaxCaspase-3的表达,抑制细胞凋亡,高浓度硝酸钇可致神经元细胞生长抑制率增加,并抑制细胞中Bcl-2的表达,激活Bax和Caspase-3的表达,从而诱发细胞凋亡；Bcl-2/Bax比值总体上也呈现出先上升再下降的趋势,表明硝酸钇对小鼠胚胎干细胞神经发育的影响具有剂量依赖性,提示细胞凋亡可能是硝酸钇神经发育影响的作用机制之一。2.首次按照OECD426神经发育毒性试验指南对硝酸钇大鼠的神经发育毒性进行评价,证实硝酸钇影响大鼠体重增加,这种毒作用具有暴露依赖性和可恢复性。结果显示,本试验条件下,通过宫内和哺乳暴露的方式,硝酸钇能够促进雌、雄仔鼠体重的增重,但断乳后(停止受试物暴露),体重差异会逐渐消失。未见硝酸钇对喂饲组雌、雄仔鼠的早期神经发育和神经行为造成影响。硝酸钇在神经发育毒性试验大鼠的NOAEL值为45mg/kg/day,相当于钇元素的NOAEL值为14.6 mg/kg/day。3.本研究在OECD426的基础上增设给药组实验。结果显示,断乳后继续灌胃给予仔鼠宫内暴露时相同剂量的受试物,从PND42天开始至实验结束,雄性45 mg/kg/day剂量组体重显著低于对照组(p<0.05)。雌鼠体重表现出相同的趋势,但雌鼠各剂量组、雄鼠其他剂量组与对照组比较均未见统计学差异(p>0.05)。给药组实验研究提示后期持续暴露,硝酸钇存在潜在的发育毒性。4.首次开展硝酸钇对海马中凋亡通路和Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信号通路几种重要信号分子表达的初步研究,提示硝酸钇可以引起CaM mRNA表达水平的变化,这可能与钇离子和Ca2+内流有关。但本试验条件下,未见硝酸钇对PND21天和PND70天雌、雄仔鼠海马中凋亡调控相关基因和蛋白、CaMKⅡ、CREB和BDNF基因与蛋白的表达水平产生有实际意义性的改变。