通量化蛋白质芯片新技术的研究

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正如基因芯片可以在基因组的水平上对人类基因序列进行高通量、规模化和系统性的分析,并且已经为人类在基因水平上揭示疾病的发生和发展做出了重要的贡献。随着蛋白质组学的兴起,蛋白质芯片即蛋白微阵列芯片凭借其高通量、高特异性和高灵敏度等特点也在蛋白质组学的研究中起到了重要的作用。另外,随着蛋白质组学的推动,蛋白质芯片也迅速得到不断的完善和发展,其中传统的标记型检测技术由于自动化程度较高已经被广泛地应用,但是昂贵的蛋白质芯片制备与检测设备是阻碍其广泛应用的一个重要因素。最近出现了一种无标记检测技术,它具有无需对样品标记,可以更好保持生物分子的活性,以及操作简便、快捷等优点,不仅有希望成为一类新型的蛋白质芯片分析技术,而且也为蛋白质芯片技术的分析能力提供了更强大的发展潜力。这些蛋白质芯片分析新技术越来越多地应用于蛋白质组学、疾病标志物的发现和药物筛选等系统性研究中,显示出它们在生物科学研究中的巨大潜力。 本论文分别对蛋白质芯片的标记型检测新技术和无标记检测新技术进行了探索。在标记型检测新技术中,首先将琼脂糖印章技术与银增强法检测技术结合起来,用于蛋白芯片的制备与检测。在实验中,对一系列影响蛋白质芯片制备及检测的因素进行了探讨,如蛋白微阵列点的均匀性、蛋白印制后的活性等。然后分别采用直接法和夹心法考查琼脂糖印章结合银增强法的定量分析能力。结果表明直接法检测的最低检测限为0.33fmol;夹心法检测的最低检测限为0.13fmol。这些结果进一步用荧光法进行了验证。最后,通过连续印制蛋白微阵列点内的标准平均差(CV1)和第一次印制与后续印制蛋白微阵列点间的标准平均差(CV2)对琼脂糖印章平行化制备蛋白质芯片的能力进行了评价。由于这两种技术均具有价格便宜,易于操作等特点,有望成为一套新型的蛋白芯片制备与检测技术。在第二个实验中,将电化学阵列传感芯片与电化学阻抗谱技术结合开发出一种新型电化学阵列传感分析技术,对多种抗原抗体反应进行检测。实验中以HBsAg作为模式抗原对传感器的性能进行了系统的评价。其中抗体可以通过自组装技术固定在金电极的表面。电极表面在抗体固定、与抗原、HRP标记的二抗及AEC底物作用后分别用原子力显微镜技术和电化学阻抗谱技术进行了表征。结果发现在10pg/ml到1ng/ml的范围内阻抗值与HBsAg浓度呈现出较好的线性关系,检测限可以达到10pg/ml。最后,将羊抗人IgG、抗HBs和抗HBe固定在阵列电极表面制备抗体阵列分别对鼠IgG,HBsAg和HBeAg以及它们的混合样品进行了分析,样品浓度均为100pg/ml。结果发现抗体阵列可以有效地检测出目的蛋白,并且没有明显的交叉反应。这些结果证明了电化学阵列传感器分析多种抗原抗体的可行性,为将来用于临床诊断研究奠定了基础。在无标记检测新技术中,建立了一种电化学阻抗法结合蛋白阵列传感电极实施无标记检测多种抗原抗体结合反应的分析技术。首先通过蒸汽沉积法制备带有24个金工作电极的传感芯片,不同蛋白可以通过自组装分子层固定在不同的电极上;为了更好地观察多种抗原抗体间的结合情况,对一系列实验条件进行了比较与优化,其中包括固定蛋白的浓度、固定不
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