【摘 要】
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疟原虫没有从头合成嘌呤的途径,依靠补救合成途径以利用现成嘌呤碱或嘌呤核苷.为满足红细胞内期疟原虫大量裂体增殖,嘌呤补救合成十分活跃.参与嘌呤补救合成的酶有腺苷脱氨酶
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疟原虫没有从头合成嘌呤的途径,依靠补救合成途径以利用现成嘌呤碱或嘌呤核苷.为满足红细胞内期疟原虫大量裂体增殖,嘌呤补救合成十分活跃.参与嘌呤补救合成的酶有腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)等,其中PNP是关键酶.该研究对中国恶性疟原虫FCC1/HN分离株PNP基因进行克隆表达,并对其功能做了初步研究.方法从液氮罐中取出保存的恶性疟原虫FCC1/HN分离株复苏,用人"B"型红细胞悬液及含10％人"AB"型血清的RPMI1640培养液在37℃ 5%CO2培养箱中进行体外连续培养.当恶性疟原虫密度达到5%~10%时收集虫体并提取其基因组DNA.以基因组DNA作为模板扩增出恶性疟原虫PNP基因,克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET30a(+)-PNP.以上重组质粒经PCR、酶切鉴定和基因序列测定验证.将重组质粒pET30a(+)-PNP转化入大肠杆菌中,在IPTG的诱导下表达His-Taged融合蛋白,纯化表达产物,并进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定.根据PNP可以催化无机磷与次黄嘌呤核苷生成黄嘌呤,黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化下生成尿酸,通过测定尿酸的生成鉴定表达蛋白的酶活性.结论在大肠杆菌中表达了融合蛋白,并进行了纯化和酶活性的测定,结果表明在大肠杆菌中表达了具有酶活性的融合蛋白.
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