在自然界生命体中,蛋白质是构筑组织结构和实现生物功能的基本单元,其结构极具多样化的特征。通过分子间不同的弱相互作用,蛋白质单体可以有序地组装成各种复杂结构。对于外部环境的变化,这些天然产生的高度有序的组装体可以实现结构上的动态变化,以调节其生物功能来维持有机体的生命活动。近几十年中,对于蛋白质组装方面的研究越来越受到科学家们的广泛关注。蛋白质自组装行为的研究,加深了对天然蛋白质组装体的组装机制的了解,同时为开发基于蛋白质的生物材料提供了新的方法。人们利用不同驱动方式和设计策略来构建有序组装的蛋白质聚合体,并取得了令人瞩目的研究成果。其中超分子相互作用作为一种非共价相互作用,由于其具有特异性结合能力、动态可调节和普遍适用性等特殊的性质,常常作为驱动力诱导构筑单元有序结合并最终得到复杂组装体的有效方法。常见的超分子相互作用例如氢键作用,电荷作用,金属配体配位,?-?共轭作用,亲疏水相互作用和主-客体相互作用等都通过调节单体间的连接在控制组装体形成方面实现了应用。蛋白质片段重组是一种基于超分子相互作用的自然现象。当一些蛋白质在某一特定位置被拆分成两部分时,能够通过片段间特异性识别并且重新组装恢复为完整结构,这一重组后的蛋白具有与原来相似的性质与功能。这一现象的发现对于利用超分子相互作用驱动蛋白质组装体形成提供了有利的构建工具,并为开发功能性生物材料开辟了全新的解决思路。本研究的目标是利用蛋白质片段重组体系的特性驱动蛋白质组装体形成,并实现对动态组装体的精确调控,以达到模拟生命体中组织、蛋白从而构建功能性生物材料的目标。我们设计并构建了具有氧化-还原电势和温度双重响应能力的可重组蛋白质片段G_N和G_C,以此体系作为构筑基元和驱动力,结合超分子相互作用与共价作用,并通过对环境的精确控制实现对不同程度的组装体系的指导构建、动态调控以及功能化。1.基于超分子自组装策略构筑超高分子量titin模拟物天然弹性蛋白在多种生物过程中都处于机械应力的作用之下,并且作为分子弹簧为组织提供所需的机械性能。这些弹性蛋白有一个共同特征就是它们是通过折叠蛋白结构域重复串联得到的。肌肉蛋白titin作为细胞中最大的蛋白质,由超过34000个氨基酸残基组成,具有超过3.5 MDa的超高的分子量,负责着肌肉的被动弹性。Titin由上百个单独折叠的球状结构域串联而成,因而可以看作是以球状蛋白为大分子单体形成的蛋白质聚合物。由于titin的超高分子量,设计具有类似分子量的titin模拟蛋白聚合体一直是一个具有挑战性的课题。利用一种小蛋白GB1的突变型GL5CC的蛋白质片段重组性质,即分裂后的两部分片段G_N和G_C能够通过超分子相互作用特异性识别并重新组装成为一个完整结构域。利用这一特殊方法我们发展了一种基于蛋白质片段重组的超分子组装策略来构建具有超高分子量的超分子组装体。我们发现经过设计得到的双官能团大分子单体蛋白能够通过头-尾相连的方式高效、有序地组装,并得到平均分子量为0.5 MDa的超高分子量线形组装体。这种高分子量的线形组装体与titin蛋白非常相似,并且为构建具有更优物理和机械性能的生物材料提供了难得的构筑基元。2.主-客体化学驱动互斥蛋白构建动态多维度蛋白质组装体在生命体细胞内,蛋白质组装体是最重要的工作机器,维持着多种多样的生命活动。天然的蛋白质组装体是动态的,并且能够伴随环境的改变做出响应以实现各种特定的生物功能。受到大自然的启发,科学家们在探索人工构建的蛋白质纳米结构方面付出了很多的努力也取得了相当重要的研究进展。不同形貌的蛋白质组装体如纳米线、纳米微管、纳米片层和纳米笼状结构等,从一维到三维的组装结构,都通过合理设计和对蛋白质间相互作用的精确控制而成功实现。同时,对不同条件响应的蛋白质组装体如pH值、氧化-还原电势、温度、光和离子等也得到开发。然而,由于天然蛋白构筑基元结构的局限性和不可控性,使得构建具有可逆变换形貌的刺激响应蛋白质组装体有很大难度。经过仔细的设计与考量,我们通过引入基于蛋白质重组作用和热力学稳定性构建的互斥蛋白(MEP)来解决这一难题。利用基因工程我们得到了一种全新的包含MEP结构域的刺激响应融合蛋白,并能在以CB[8]为基础的超分子相互作用驱动下形成动态蛋白质组装体。通过调节组装条件为氧化或者还原状态,构筑基元的构象会发生显著变化,从而最终造成组装体形貌从一维线形到二维环形的动态转变。该组装体系这种可精确调控形貌的特性,使其具有作为生物材料的潜在应用价值。3.基于蛋白质片段重组构建动态可逆修饰的功能蛋白质水凝胶细胞外基质(ECM)是哺乳动物中多种组织的重要组成部分,负责许多细胞层面上的精细生物过程。通过传递细胞信号,ECM可以实现对多种细胞行为如细胞的黏附、迁移、分化和凋亡等的调控。合成聚合物或重组蛋白构建的水凝胶由于具有较高的含水量和可调的理化及机械性能,常作为模拟ECM的材料获得在生物医学领域中不同的应用。由于细胞行为往往是动态的,因此通过可控的方式使得水凝胶能够可逆地结合与释放功能性信号分子对于其生物应用方面是至关重要的。为了实现这一目标,人们构建了由生物惰性聚合物形成的水凝胶“空白板”并通过各种生物偶联方法在空白的水凝胶上修饰上将所需要的信号分子。这种方法在合成聚合物水凝胶中得到了广泛应用并取得了较大的成功,然而,其在蛋白质水凝胶当中的应用却仍是挑战。针对这一难题,我们首次提出了利用蛋白质片段重组的可逆生物偶联法来实现蛋白质水凝胶对配体分子的可逆结合与释放。由于应用的重组蛋白具有氧化-还原和温度双重响应的特性,我们可以通过改变环境来控制配体对蛋白质水凝胶的修饰行为,因此来调节水凝胶的生化性质以适应不同的应用。该方法适用于不同的蛋白质甚至合成聚合物水凝胶,并由于这种ECM模拟体系有利于对细胞行为的探究,因而在仿生生物材料领域具有巨大的应用前景。