胎儿炎症反应综合征（fetal inflammatory response syndrome,FIRS）是指胎儿免疫系统被激活释放大量致炎因子而导致的一种亚临床状态,是全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）在胎儿期的特殊表现形式,与早产密切相关,是除窒息外又一重要脏器损伤因素,常累及肺、心脏、中枢神经系统、胃肠道、肾脏、皮肤等重要脏器。随着生殖医学飞速发展,产、儿科诊疗水平不断提升,近年来早产儿的出生率上升至5%¹5%,早产儿乃至超早产儿数量明显增多,故其存活及转归成为国内外学者研究关注的热点,其中心肺损伤是引发死亡及预后欠佳的重要病因,FIRS与心肺损伤的关系也逐渐引起关注。支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）及心肌损伤是早产儿心肺损伤的代表性疾病,均与FIRS关系密切。BPD是早产儿、尤其是超早产儿呼吸系统常见病,鉴于其独特的起病方式、临床及影像学表现,被国内外学者所关注,是致死的重要病因之一,亦是婴儿期慢性呼吸系统疾病的主要因素及儿童期哮喘的诱因之一。资料显示,存在炎症反应的极低出生体重儿,其肺泡灌洗液中IL-1、IL-6等炎性细胞因子浓度上升,更易发生BPD;国外亦有研究显示在70例BPD患儿中,胎儿炎症反应的发生率高达76%。心肌损伤起病隐匿,临床表现多样,早期无特异性预测指标,容易漏诊,以致延迟治疗、预后不良,该病在早产儿中发病率约30%左右,而在FIRS早产儿中可上升至46.8%,其中致心律失常发生率约4.28%,死亡率约0.6%¹%。虽前期研究提示FIRS可引起心肺损伤,但其具体机制仍未探究清楚,这也使得探寻心肺损伤的早期预测指标及新型治疗方法遇到障碍,因此探究FIRS引起心肺损伤的发病机制尤为必要。FIRS与SIRS在疾病发生及病情进展中存在诸多相似之处,在SIRS的研究中发现,IL-6、IL-8等炎性细胞因子与基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases,MMP-9）协同作用,加重炎症反应的同时促进MMP-9分泌,造成并加重脏器炎症损伤。MMP-9是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）中明胶酶家族的重要成员,与其抑制剂基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMP-1）在多器官的发育与重建发挥重要作用,其在肺发育各个阶段均有表达,且动物实验中MMP-9受辐射、高氧等影响而表达上调时,引发肺泡损伤及肺纤维化。I、III型胶原纤维是心脏胶原的主要组成纤维,此外还包括少量IV型胶原纤维,MMP-9亦可参与心脏胶原纤维的代谢,当MMP-9表达上调,可引起心脏胶原纤维代谢紊乱,造成心肌损伤,甚至心室壁变薄、心功能下降。本课题研究:FIRS的发生是否会引起MMP-9的过度表达及MMP-9/TIMP-1比值的紊乱;MMP-9、TIMP-1水平的改变是否是FIRS引发心肺损伤的机制之一;MMP-9能否成为预测心肺损伤早期临床指标并为治疗提供线索。目的:1临床实验部分:1.1通过检测FIRS早产儿与对照组早产儿脐血MMP-9、TIMP-1水平,探究FIRS早产儿脐血MMP-9、TIMP-1水平的变化;1.2探究FIRS早产儿脐血IL-6水平与MMP-9、TIMP-1水平及二者比值（以下简称M/T）的相关性,以期进一步阐明FIRS病程中IL-6与MMP-9是否存在协同关系,以致进一步加重炎症损伤;1.3动态随访各组病情进展、转归,确定研究对象中BPD及心肌损伤的发生情况,探讨FIRS及MMP-9、TIMP-1变化与心肺损伤的关系。2动物实验部分:2.1通过建立FIRS昆明小鼠模型,观察FIRS鼠心肺组织病理改变及MMP-9、TIMP-1表达变化,研究两者表达改变与心肺损伤关系,探究MMP-9过度表达是否是FIRS引发心肺损伤的机制之一;2.2通过观察FIRS模型在MMP-9抑制剂干预下心肺组织病理变化,探究下调MMP-9表达对心肺发育的保护作用;2.3综合临床实验及基础实验结果,展望MMPs抑制剂应用对胎儿及早产儿早期心肺损伤的改善作用。方法:1临床实验部分1.1研究对象及分组选取2014.5-2015.12于河北医科大学第四医院及第二医院出生的早产儿,排除神经系统或者其他系统严重畸形或是罹患遗传代谢性疾病的患儿、母亲在分娩前存在妊娠合并非感染疾病（妊娠合并肺部疾病、心脏病、糖尿病、子痫以及贫血等）的患儿、以及存在产伤或分娩中发生窒息缺氧的患儿。共采集病例118例。根据FIRS诊断标准及胎龄分为四组:对照组1（胎龄≤32周,非FIRS）:25例;对照组2（32周<胎龄<37周,非FIRS）:32例;实验组1（胎龄≤32周,FIRS）:33例;实验组2（32周<胎龄<37周,FIRS）:28例。1.2标本留取及制备入组早产儿生后即断脐,从胎儿端留取脐静脉血2³ml,离心后收集血清;于产中采取羊水2³ml,离心后收集上清液,均-80℃保存待检。胎盘一经娩出即在相对无菌条件下采集胎盘、脐带、胎膜等组织并置于中性甲醛溶液中,保存在4℃冰箱中待检。1.3实验指标测定1.3.1采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）的方法检测脐血中的IL-6、MMP-9、TIMP-1水平;免疫比浊法测定羊水CRP;瑞氏染色观察羊水涂片;苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察胎盘组织病变。1.3.2动态随访研究对象,随访时间≥1月,明确随访对象是否发生BPD、心肌损伤,并分别记录疾病发生例数,计算研究对象中疾病发生率。2动物实验部分2.1模型制备制备昆明小鼠（KM小鼠）孕鼠30只,随机分为3组（n=10只）,分别为:对照组（control group）、FIRS组（FIRS group）、FIRS干预组（RA group）。借鉴Samuli Rounioja[1]等人FIRS模型制备方法:孕15日（G15d）将FIRS组及FIRS干预组孕鼠羊膜囊内注射LPS（0.25ug-2.5ug/sac,总量不超过100ug/Kg）,采用同样方法将对照组孕鼠羊膜囊内注射等体积生理盐水（normal saline,NS）。FIRS干预组在孕17日（G17d）开始MMP-9抑制剂-维甲酸（retinoic acid,RA）（50ug/Kg）腹腔注射,直至生产。2.2标本留取分别从对照组、FIRS组及FIRS干预组中各随机取3只孕龄19日（G19d）孕鼠,行剖宫产手术,留取胎鼠的胎盘及心肺组织,余孕鼠等待自然分娩,均保留存活新生鼠。于生后第1、3、7、14天（P1.3.7.14d）分别处死三组小鼠（每组每时间点8只）,留取心肺组织,将所有留取的组织分为两份,一份置于中性甲醛溶液中固定后石蜡包埋用于HE染色,另一份液氮速冻后置-80℃用以实时荧光定量PCR（real-time PCR,RT-PCR）。2.3实验指标检测2.3.1观察各组孕鼠手术后生命活动,记录流产数、死产数及新生鼠死亡数,密切观察新生鼠生命活动;2.3.2测量各组胎鼠、新生鼠体重、肺重,计算肺指数（肺重/体重）;2.3.3通过HE染色观察各组胎盘及胎鼠、新生鼠心肺组织的病理变化;2.3.4通过HE染色观察各组新生鼠肺泡辐射计数（alveolar radiation count,RAC）变化;2.3.5采用RT-PCR检测各组胎鼠、新生鼠心肺组织中IL-6、MMP-9、TIMP-1的相对表达量。3统计学分析所有数据应用统计学软件SPSS13.0进行分析处理,计量资料均进行正态性检验,符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（X|-±S）表示,不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）（M（Q））表示,计数资料采用率（%）表示。计量资料:符合正态分布的两组均数的比较采用成组t检验（t-test）;正态分布及方差齐多组均数的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,组间多重比较采用SNK法（Student-Newman-Keuls）;偏态分布数据多组比较采用Kruskal-wallis H检验,两两比较采用Mann-Whitney U检验;相关性分析采用Spearman’s线性相关。计数资料:两组资料比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。结果:1临床实验结果1.1早产儿脐血IL-6、MMP-9、TIMP-1水平变化1.1.1 FIRS早产儿脐血IL-6、MMP-9、TIMP-1水平变化（组间比较）胎龄<32周的FIRS早产儿脐血IL-6、MMP-9、TIMP-1及M/T（MMP-9/TIMP-1比值）水平均明显高于同胎龄对照组（P<0.01）;胎龄>32周的FIRS早产儿脐血IL-6、MMP-9、TIMP-1及M/T（MMP-9/TIMP-1比值）水平均明显高于同胎龄对照组（P<0.01）。1.1.2不同胎龄早产儿脐血IL-6、MMP-9、TIMP-1水平变化（组内比较）在FIRS早产儿中:胎龄<32周者IL-6水平明显高于胎龄>32周者（P<0.05）,而MMP-9、TIMP-1及M/T水平与胎龄>32周者无统计学差异（P>0.05）;在对照组中:胎龄<32周者IL-6水平与胎龄>32周者无统计学差异（P>0.05）,而MMP-9、TIMP-1水平明显低于胎龄>32周者（P<0.01）,M/T明显高于胎龄>32周者（P<0.01）。1.1.3 FIRS早产儿脐血IL-6与MMP-9、TIMP-1、M/T相关性分析FIRS早产儿脐血IL-6与MMP-9呈正相关（PMMP-9<0.01,r MMP-9=0.875）;IL-6与TIMP-1呈正相关（PTIMP-1<0.01,r TIMP-1=0.874）;IL-6与M/T呈正相关（PM/T<0.01,r M/T=0.745）。1.2 FIRS患儿胎盘病理改变实验组胎盘组织与对照组相比存在炎性浸润,炎性细胞聚集:急性炎症组织可见大量中性粒细胞聚集,组织充血、水肿;慢性炎症组织可见中性粒细胞淋巴细胞、单核细胞等炎细胞浸润,组织可见坏死及增生;绒毛膜羊膜炎病变多集中在绒毛膜部位,可见中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞等急慢性炎细胞浸润。对照组胎盘组织正常。1.3 FIRS患儿羊水涂片改变实验组羊水涂片与对照组相比:可见炎细胞聚集,多以中性粒细胞为主,也可见淋巴细胞聚集。对照组涂片以脱落的上皮细胞为主,含少许杂质。1.4早产儿BPD及心肌损伤发病率的改变1.4.1 FIRS早产儿BPD及心肌损伤发病率的改变（组间比较）胎龄<32周FIRS早产儿BPD及心肌损伤的发生率均高于同胎龄对照组（P<0.05）;胎龄>32周FIRS早产儿心肌损伤的发生率明显高于同胎龄对照组（P<0.05）,而BPD的发生率无统计学差异（P>0.05）。1.4.2不同胎龄早产儿BPD及心肌损伤发病率的改变（组内比较）在FIRS早产儿中:胎龄<32周者BPD发生率明显高于胎龄>32周者（P<0.01）,心肌损伤的发生率无统计学差异（P>0.05）;在对照组中胎龄<32周者BPD及心肌损伤发生率较胎龄>32周者均无统计学差异（P>0.05）。2动物实验结果2.1孕鼠围产期情况及胎鼠、新生鼠存活情况制备KM小鼠孕鼠30只,孕15日在羊膜囊内分别注射LPS和NS处理,注药后无孕鼠死亡事件发生;注药48小时内FIRS组出现2例阴道流血后流产事件,FIRS干预组出现1例阴道流血后流产事件,对照组无流产事件发生,流产率为10%（3/30）。去除流产孕鼠,余孕鼠一般情况可,生理活动正常。孕鼠分娩情况:对照组共获97（97/98）只胎鼠和64（64/65）只新生鼠,FIRS组共67（67/79）只胎鼠和33（33/42）只新生鼠,FIRS干预组共82（82/87）只胎鼠和46（46/52）只新生鼠。将剖宫产及顺产娩出的胎盘进行病理检查,胎盘组织存在炎性浸润者认为制模成功,本实验制模成功率83.73%（139/166）。2.2不同日龄FIRS鼠体重、肺重及肺指数的变化FIRS发生后,19日龄胎鼠及1、7、14日龄新生鼠肺重较同日龄对照组明显减轻（P<0.05）;19日龄胎鼠及1日龄新生鼠体重较同日龄对照组明显减轻（P<0.05）;19日龄胎鼠及1、7日龄新生鼠肺指数较同日龄对照组明显降低（P<0.05）。当RA干预后,仅19日龄胎鼠及1日龄新生鼠较对同日龄对照组肺重明显减轻（P<0.01）、且该日龄胎鼠及新生鼠较同日龄FIRS组肺重明显增加（P<0.01）;仅19日龄胎鼠体重较同日龄对照组减轻（P<0.01）、且该日龄胎鼠较同日龄FIRS组体重明显增加（P<0.01）;仅19日龄胎鼠及1日龄新生鼠肺指数较同日龄对照组明显降低（P<0.01）、且该日龄胎鼠及新生鼠较同日龄FIRS组肺指数明显升高（P<0.01）。本实验中各组肺重、体重均随日龄不断增加,FIRS组肺重、体重发育整体落后于对照组,RA干预后好转,肺指数在生后14日达到最低。2.3 FIRS鼠胎盘及心肺组织病理改变2.3.1胎盘组织:FIRS组与对照组病理比较:胎盘组织可见大量炎细胞浸润,绒毛结构消失,可见水肿部分纤维化。2.3.2肺组织:FIRS组与对照组病理比较:FIRS组肺泡数目减少,肺泡间隔减少、增厚,间质部分及肺泡内可见少量出血,部分肺泡结构破坏;FIRS干预组与FIRS组病变相似,程度明显减轻。2.3.3心脏组织:FIRS组与对照组病理比较:FIRS组心肌组织可见出血灶及水肿,心室壁变薄;FIRS干预组与FIRS组病变相似,程度明显减轻。2.4不同日龄FIRS鼠RAC的变化发生FIRS后,7、14日龄新生鼠RAC较同日龄对照组明显减少（P<0.01）;RA干预后,7、14日龄新生鼠RAC仍较同日龄对照组明显减少（P<0.01）、但较同日龄FIRS组明显增加（P<0.01）。随日龄增长,各组RAC不断增加,FIRS组肺泡发育整体落后于对照组,RA干预后好转,本实验中14日龄RAC值最高。2.5不同日龄FIRS鼠心肺组织IL-6、MMP-9、TIMP-1表达水平变化2.5.1心脏:发生FIRS后:19日龄胎鼠及1、7、14日龄新生鼠IL-6、MMP-9表达水平及M/T比值均明显高于同日龄对照组（P<0.05）。RA干预后:19日龄胎鼠及1、7、14日龄新生鼠IL-6、MMP-9表达水平及M/T比值仍明显高于同日龄对照组（P<0.05）,但该日龄新生鼠MMP-9表达水平及M/T比值则明显低于同日龄FIRS组（P<0.01）。2.5.2肺脏:发生FIRS后:19日龄胎鼠及1、7、14日龄新生鼠IL-6、MMP-9表达水平及M/T比值均明显高于同日龄对照组（P<0.05）。RA干预后:19日龄胎鼠及1、7、14日龄新生鼠IL-6、MMP-9表达水平及M/T比值仍明显高于同日龄对照组（P<0.05）,但该日龄胎鼠及新生鼠MMP-9表达水平及M/T比值则明显低于同日龄FIRS组（P<0.01）。2.6 FIRS鼠心肺组织IL-6与MMP-9、TIMP-1及M/T的相关性分析2.6.1心脏:IL-6与MMP-9呈正相关(PMMP-9<0.01,r_MMP-9=0.705);IL-6与M/T呈正相关(PM/T<0.01,r_M/T=0.496);IL-6与TIMP-1无线性关系（PTIMP-1=0.207,r TIMP-1=0.229）。2.6.2肺脏:IL-6与MMP-9呈正相关(PMMP-9<0.01,r_MMP-9=0.551);IL-6与M/T呈正相关(PM/T<0.01,r_M/T=0.369);IL-6与TIMP-1无线性关系（PTIMP-1=0.119,r TIMP-1=0.281）。结论:1不同胎龄FIRS早产儿脐血MMP-9水平及M/T比值均明显升高,且与BPD及心肌损伤发生率相关,提示MMP-9升高及M/T比值紊乱是FIRS引发心肺损伤的分子基础之一,并有望成为早产儿BPD及心肌损伤的早期预测指标。2 FIRS早产儿脐血中IL-6与MMP-9及M/T呈正相关,提示在FIRS病程中IL-6与MMP-9具有协同关系,MMP-9可与炎性介质相互作用参与并加重心肺炎症损伤。3 FIRS可引发小鼠心肺损伤,并上调组织MMP-9表达,MMP-9抑制剂可明显下调组织中MMP-9表达,且使病理改变改善,进一步提示MMP-9水平及M/T比值升高是FIRS引发心肺损伤的分子基础,而MMP-9抑制剂可在心肺损伤过程中发挥保护作用。4 FIRS鼠心肺组织中MMP-9与IL-6表达呈正相关,提示在FIRS引发心肺组织损伤的过程中IL-6与MMP-9存在协同作用。