【摘 要】
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外泌体是一种直径在40-200nm的细胞外囊泡,其天然具有良好的生物相容性、循环稳定性、生物屏障渗透性、低毒性和低免疫原性等优势,使其成为了RNA、小分子化合物等药物递送载体的研究热点。对于外泌体负载RNA分子的方法,目前常采用外源性载药的方式,如电穿孔、化学转染和孵育等完成载药。但这种载药方式存在外泌体制备质量低、电穿孔条件受限、转染效率低等问题。而内源性载药研究较少,是由于药物进入外泌体内的机
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外泌体是一种直径在40-200nm的细胞外囊泡,其天然具有良好的生物相容性、循环稳定性、生物屏障渗透性、低毒性和低免疫原性等优势,使其成为了RNA、小分子化合物等药物递送载体的研究热点。对于外泌体负载RNA分子的方法,目前常采用外源性载药的方式,如电穿孔、化学转染和孵育等完成载药。但这种载药方式存在外泌体制备质量低、电穿孔条件受限、转染效率低等问题。而内源性载药研究较少,是由于药物进入外泌体内的机制复杂、负载率不确定等原因。本研究尝试利用L7Ae与K-turn(Kt环)结构特异性结合的特性,探索一种外泌体高效包载RNA分子的新方法。首先我们构建了表达CD63-L7Ae融合蛋白的重组质粒,并转染到HEK293T细胞中,提取细胞分泌的外泌体进行Western blot和粒径分析鉴定。发现外泌体中富含CD63-L7Ae融合蛋白,且外泌体的直径大小与天然外泌体一样,说明CD63-L7Ae修饰并不会对外泌体的物理性质产生影响。然后我们构建了含有Kt环的沉默EGFP蛋白的sh RNA表达载体,并在HEK293T细胞上证明其可以降低EGFP表达。其后我们构建了重组L7Ae质粒并瞬转到HEK293T细胞,证明L7Ae在HEK293T细胞中能够与Kt环结合。随后我们把含有Kt环的沉默EGFP蛋白的sh RNA表达载体(p RNAT-U6.1/Neo-Kt-sh EGFP)与重组CD63-L7Ae融合表达质粒转染到HEK293T细胞,并对分泌的外泌体Kt-CD63L7Ae-Exo进行q RT-PCR和活性验证,证明了Kt-CD63L7Ae-Exo内的Kt-sh EGFP含量明显上升,且把装载sh RNA的外泌体转染受体细胞后,Kt-sh EGFP在受体细胞中同样具有沉默功能。接着我们验证了该策略是否可应用于m RNA的外泌体载药。鉴于研究发现NAMPT是通过外泌体的形式分泌到胞外的,且只有Ev(Extracelular vesicle,细胞外囊泡)包裹的e NAMPT才能进入细胞内,所以我们选择NAMPT(烟酰胺磷酸核糖转移酶,nicotinamide phosphoribosyl transferase)作为m RNA模式药物。构建了携带Kt环的m RNA的表达载体(p CMV-NAMPT-Kt),与CD63-L7AE重组质粒共同转染293T细胞,收取外泌体,通过q RT-PCR检测证明了外泌体中含有大量的NAMPT的m RNA,其含量比对照组(未转染重组质粒和未转染CD63-L7Ae质粒)有显著提高。含有NAMPT-CD63-L7Ae的外泌体转染受体细胞293T后,发现在受体细胞内m RNA可以翻译表达NAMPT蛋白,并且具有去乙酰化的功能。综上所述,我们利用L7Ae蛋白与Kt环特异性结合的原理获得靶向包裹RNA分子的外泌体,使外泌体成为一种有效的RNA药物载体,并让其携带RNA进入到受体细胞中。
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