RBSDV P7-2基因重组AcMNPV及其生物学研究

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本研究将具有诱导细胞凋亡功能的水稻黑条矮缩病毒(Rice blackstreaked dwarf virus,RBSDV)P7-2基因重组到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的基因组中,以期为遗传修饰杆状病毒、提高杀虫效果提供新思路。  将带有SV40终止子的AcMNPV多角体基因ph、AcMNPV ie-1启动子、在C端融合Flag标签的P7-2基因依次插入到供体质粒pFastBac-HTB的多克隆位点处,使用供体质粒pFastBac-HTB自身的启动子及ie-1启动子分别启动ph和P7-2 基因的表达。通过转座的方法将 ph、P7-2 基因及启动子插入到 bacmid bMON14272的多角体位置,获得重组bacmid Ac-P7-2,并通过Western blot检测了P7-2基因的表达。在细胞水平上观察了两种病毒的多角体形成和统计了不同时间死亡细胞数量。通过病毒生长曲线和DNA复制曲线的测定,对比研究了两种病毒的增殖和DNA复制差异。将重组病毒Ac-P7-2和野生型病毒Ac-wt分别感染3龄甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫,对比研究了P7-2基因重组AcMNPV的杀虫效果。取得的主要结果如下:  1.成功构建了P7-2基因能正常表达的重组杆状病毒Ac-P7-2。  2.Ac-P7-2能够包装成正常的病毒粒子。从转染后48 h到144 h,Ac-P7-2从形成多角体到细胞破裂释放多角体的速度快于野生型病毒Ac-wt。在转染sf9细胞后48 h、72 h、96 h、120 h,重组病毒Ac-P7-2转染后的细胞死亡数量显著高于Ac-wt(P<0.01),对宿主细胞有较强致死作用。  3.两种病毒的病毒生长曲线表明,转染48 h后,Ac-P7-2 BVs的增殖速度显著快于Ac-wt(P<0.01)。两种病毒的DNA复制曲线表明,在转染后72 h、96 h、120 h,Ac-P7-2在sf9细胞中的DNA复制能力显著高于Ac-wt(P<0.01)。  4.以3龄甜菜夜蛾幼虫为供试昆虫,测定了两种病毒的LD50、LD90、LT50及LT90,结果表明,Ac-P7-2的LD50值约为Ac-wt的1/6,LD90值约为Ac-wt的1/5,表明Ac-P7-2比Ac-wt具有更高的毒力。Ac-P7-2比Ac-wt的LT50少2.4天,Ac-P7-2比Ac-wt的LT90少3.4天,Ac-P7-2具有更快的杀虫速度。
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