论文部分内容阅读
目的:肾性贫血是慢性肾衰竭病人常见的并发症之一, EPO是治疗肾性贫血的主要药物,但是外源性EPO有诸多不良反应(如高血压、血粘度的升高、血管通路血栓形成、透析管道凝血、高钾血症、肌痛、流感样症状等),且尚有部分病人对rHuEPO反应低下。正常情况下成人EPO90%由肾脏产生,不到10%来自肝脏。肾脏产生EPO的部位为肾小管周围的成纤维样细胞。慢性肾衰竭时,肾性贫血与肾功能受损,EPO分泌不足相关。肾脏EPO产生减少,肾外EPO如何调整,怎样促使肾外EPO的产生是目前研究的疑点与难点[1]。肝再生增生强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是1994年Hagiya等从新生大鼠肝脏中纯化并克隆出的一种具有热稳定性的非特异性促进肝细胞再生因子,由125个氨基酸构成的小分子蛋白质,分子量为15 Kda[2]。ALR具有非种属、非组织、非器官特异性,在肝脏、肾脏中有高表达。慢性肾衰竭时肾脏不能产生足够的EPO,此时由于肝脏Kupffer细胞也能合成分泌EPO,所以肝脏可有一定的代偿作用[3,4]。研究发现:肝脏Kupffer细胞表面有高亲和力ALR受体,ALR能促进Kupffer细胞DNA复制,蛋白合成[4,5]。但是目前尚无肝再生增强因子(ALR)在慢性肾衰竭中的研究。本课题利用5/6肾切除大鼠模型探讨ALR在慢性肾衰竭中的作用,为肾性贫血探索新的治疗方法。如果人工合成肝再生增强因子可以治疗肾性贫血,将更符合生理要求,可减少rHuEPO的用量及其带来的许多不良反应,为重组肝再生增强因子在临床上治疗肾性贫血提供实验性理论依据。有可能使其成为一种理想的治疗方案。方法:将体重150～200g的30只SD大鼠随机分为三组,假手术组(n﹦10),仅暴露肾包膜,不做肾切除。手术组(n﹦20),参照文献[5] [8]的方法制备模型,在严格无菌条件下,切除右肾,一周后切除左肾2/3。手术组大鼠术后饲养一周后总计成活18只,随机分为对照组(n﹦9),rhALR组(n﹦9)。rhALR组大鼠于手术后12周给予rhALR200μg/kg/d,腹腔注射,对照组大鼠同时给予等量生理盐水腹腔注射。隔日注射1次,共2周。观察大鼠精神状态,活动度、毛发光泽度、摄食及死亡情况,每周观察一次体重,观察体重变化。各组大鼠于用药结束后24小时,氯胺酮麻醉后心脏采血,观察各项指标。应用日本SYSMEX型全自动血细胞分析仪测定血色素(Hb),红细胞计数(RBC),红细胞压积(Hct);采用OLYMPUS AU400型生化仪测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr);采用OLYMPUS 5400型生化仪测定血清铁蛋白;采用美国ADL公司ELISA试剂盒测定血清EPO水平。Masson染色观察肾脏病理学改变,HE染色观察肝脏病理学改变。免疫组织化学法检测肝肾组织中的肝再生增强因子(ALR)、增殖细胞核抗原(PCNA)。Western印迹法检测肝肾组ALR蛋白的表达。结果:1肾脏大体外观改变,对照组大鼠术后残肾体积增大,被网膜包裹难以剥离。手术切口瘢痕处内陷,其余部分外凸,形状不规则。rhALR组亦有上述改变,但较轻。2外周血象及肾功能变化:假手术组、对照组和rhALR组小鼠血Hb(g/L)分别为137.43±0.96、68.72±15.42、113.51±5.83,RBC(×1012/L)分别为7.45±0.42、4.01±1.35、6.05±0.88,HCT(%)分别为46.92±6.33、25.31±2.61、39.42±5.45,BUN (mmol/L)分别为7.52±1.36、25.35±8.91、17.22±5.17,Scr(μmol/L)分别为49.64±6.20、97.72±15.43、68.88±6.84。对照组与假手术组相比,Hb、RBC、HCT等下降(P<0.05),差异有统计学意义,而血Scr及BUN上升(P<0.05),差异有统计学意义,表明肾功能损害,造成贫血。rhALR组与假手术组比较,Hb、RBC、HCT水平仍低,Scr及BUN水平仍高(P<0.05),差异有统计学意义。rhALR组与对照组比较,Hb、RBC、HCT等显著升高(P< 0.05),而血Scr及BUN下降(P<0.05),差异有统计学意义,表明贫血改善,肾功能损害减轻。3血清EPO变化假手术组、对照组和rhALR组小鼠血EPO值(u/L)分别为12.19±1.87、1.77±0.72、8.64±2.35。对照组大鼠血清EPO明显下降,rhALR治疗后血清EPO升高,与对照组比较P<0.05,差异有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,EPO水平仍低,差异有统计学意义。表明rhALR处理后EPO分泌尚未恢复正常。4肾脏病理学变化肾脏大体外观改变,对照组大鼠术后残肾体积增大,被网膜包裹难以剥离。手术切口瘢痕处内陷,其余部分外凸,形状不规则。rhALR组亦有上述改变,但较轻。组织解剖学改变假手术组肾脏外观光滑,肾小球、肾小管、肾间质结构正常。对照组大鼠肾脏外观明显增大,呈苍白色,表面凸凹不平,肾盂扩张;光镜下Masson染色显示鼠肾小球代偿性肥大、系膜增生、局灶节段性肾小球硬化;肾小管萎缩,小管细胞可见变性、坏死、脱落;肾间质胶原成分增多,部分肾间质纤维化,局灶淋巴-单核细胞浸润伴有炎性细胞浸润。rhALR组肾小球、肾小管、肾间质纤维组织增生病变程度明显减轻。5肾组织ALR的表达变化:假手术组大鼠肾组织ALR仅在肾小管上皮细胞有少量表达,表现为肾小管上皮细胞包膜及胞浆均匀分布的细沙粒样着色。皮质区表达阴性。与假手术组相比,对照组ALR在肾小管上皮细胞表达增加(9.53±0.73 vs. 13.58±0.69,P <0.05),而rALR组表达较对照组明显上调(17.05±1.23 vs. 13.58±0.69,P<0.05),差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,(17.05±1.23 vs. 9.53±0.73,P<0.05),差异有统计学意义。在假手术组及肾衰大鼠肾小球内未见ALR表达。6肝组织ALR的表达变化:假手术组大鼠肝组织ALR仅有少量肝细胞表达;与假手术组相比,对照组肝脏ALR阳性细胞数增多(10.00±0.89 vs. 13.56±1.33,P<0.01);rALR组ALR阳性细胞数较对照组明显增多(23.01±1.22 vs. 13.56±1.33,P< 0.05),差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,(23.01±1.22 vs. 10.00±0.89,P<0.05),差异有统计学意义。7肾组织PCNA的表达变化:假手术组大鼠肾组织PCNA仅在肾小管上皮细胞有极少量表达,与假手术组相比,对照组组PCNA表达(%)增加(0.73±0.08 vs. 6.08±0.68,P <0.05),而rALR组表达较对照组明显上调(12.30±0.74 vs.6.08±0.68,P<0.05),差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,(12.30±0.74 vs. 0.73±0.08,P<0.05),差异有统计学意义。8肝组织PCNA的表达变化:假手术组大鼠肝组织PCNA仅在肝细胞有少量表达,与假手术组相比,对照组PCNA表达增加(2.33±0.11 vs. 8.27±0.30,P <0.05),而rALR组表达较对照组明显上调(12.19±0.27 vs. 8.27±0.30,P<0.05)差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,(12.19±0.27 vs. 2.33±0.11,P<0.05),差异有统计学意义。9 Western blot实验肾组织ALR蛋白表达情况:与假手术组相比,对照组ALR蛋白表达增加(0.62±0.02 vs. 0.69±0.03,P<0.05),而rALR组表达较对照组显著增加(0.82±0.05 vs. 0.69±0.03, P<0.05),差异具有统计学意义。10 Western blot实验肝组织ALR蛋白表达情况:与假手术组相比,对照组ALR蛋白表达增加(0.75±0.03 vs. 0.80±0.05,P<0.05),而rALR组表达较对照组明显增加(0.89±0.02 vs. 0.80±0.05,P<0.05),差异具有统计学意义。rhALR组与假手术组比较,(0.89±0.02 vs. 0.75±0.03,P<0.05),差异有统计学意义。结论:1 5/6肾切除大鼠制作慢性肾衰竭动物模型,尽管这一方法复杂,但其机理明确,即通过减少肾组织导致肾功能衰竭,进一步并发贫血,模型成功率高。从生化、病理和代谢等方面接近人类慢性肾衰竭,从而有助于探讨慢性肾性贫血的发病机制。2 5/6肾切除大鼠慢性肾衰竭动物模型中,肝肾组织ALR表达增加,可能为表明肾功能损害,造成贫血,肝脏肾脏ALR反应性增加,为机体代偿机制。3外源性给予rhALR后,5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠血EPO水平升高,贫血改善。肾脏病理间质纤维化改变减轻,肝肾组织ALR、PCNA表达明显上调,与EPO升高一致。证实rhALR具有促进EPO产生的作用,对5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠肾脏有保护作用。通过本实验研究, rhALR不仅能减轻5/6肾切除慢性肾衰竭模型大鼠肾性贫血,而且能降低血清BUN和SCr含量,改善其氮质血症状况。提示rhALR对5/6肾切除慢性肾衰竭模型大鼠肾功能有一定的保护性治疗作用。有关rhALR改善肾性贫血的机制,我们将作进一步研究。