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嘧菌酯是第一个甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产品,具有杀菌活性高,抗菌谱广和环境兼容性好的特点,因而在全球得到广泛使用。这类杀菌剂通过作用于真菌线粒体呼吸链中的复合物ⅡI而发挥其杀菌活性,但往往在连续使用两年后就出现抗药性。研究病原菌对该类杀菌剂的抗性,探讨抗药性的产生、抗性机制及其抗药性菌系的生长特性,对抗药性克服和延长杀菌剂的使用寿命,具有重要的意义。
从广东省各地采集了54个辣椒疫霉菌株,分别测定了菌丝体和游动孢子囊对嘧菌酯的敏感性。结果表明,辣椒疫霉菌丝生长对嘧菌酯的敏感性ECso值范围在0.1428.1.9509/~g/mL,平均值为0.9649/~g/mL:而游动孢子囊形成对嘧菌酯的ECso值范围在0.0010-0.0844/~g/mL平均值为0.0239μg/mL。本研究以辣椒疫霉菌菌丝生长ECso作为其对嘧菌酯的敏感基线离体生物测定结果表明,嘧菌酯对辣椒疫霉菌的菌丝和游动孢子囊形成都有明显的抑制作用,但是对游动孢子囊的形成的抑制效果要明显高于对菌丝体的抑制效果,水杨肟酸对嘧菌酯抑制菌丝生长的增效作用显著,而对游动孢子囊形成的增效作用不明显。
通过药剂对疫霉菌菌丝进行抗性诱导,得到了PY3菌株的3个抗性突变体和YX2的1个抗性突变体,抗药性测定表明其抗药性均达到较高的水平。遗传稳定性测定表明其中只有PY3.1的抗性能够遗传。生物学特性测定表明抗性突变体的菌丝生长速率、产生游动孢子囊能力、最适生长温度和pH值与原始菌株没有显著差异,抗体突变体的生物学特性没有改变。
本文通过对嘧菌酯处理过的PY3菌株线粒体耗氧抑制率和细胞色素c还原酶(复合物III)活性的比较,发现嘧菌酯对线粒体的呼吸耗氧量和复合物IⅡ活性都有抑制的作用,并且随着嘧菌酯浓度的增大抑制作用逐渐增强,表明嘧菌酯对辣椒疫霉菌的作用位点在线粒体的复合物III上。
对PY3和其抗性突变体PY3-1的呼吸功能的各个指标进行测定发现:PY3-1加入二磷酸腺苷(ADP)后耗氧速率(ST3)和ADP消耗完后耗氧速率(ST4),呼吸控制率(RCR),磷氧比(P/O)没有显著变化,这表明抗性菌株的呼吸功能没有受到影响。用嘧菌酯和水杨肟酸对菌丝呼吸链耗氧量测定表明,水杨肟酸对嘧菌酯的增效作用,仅表现在对抗性突变体,当反应到8rain时,PY3.1菌株线粒体的耗氧量只有嘧菌酯单独作用时的41.4%,说明旁路途径在菌丝抗性中可能起了作用。
嘧菌酯处理后,抗性菌株游动孢子囊的NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素c氧化酶活性没有发生显著变化,PY3菌株的细胞色素c还原酶的活性变化非常明显,并且随着嘧菌酯浓度的增大而活性也相应减少,当嘧菌酯的浓度为5#g/mL时,酶活较对照值下降了84.8%,而突变体的酶复合物Ⅲ的活性变化不显著,说明受嘧菌酯作用后,复合物ⅡI没有受到完全抑制并且继续进行生理功能。