糖代谢在发育过程中起到重要作用,例如为多种生物学过程提供能量和参与表观遗传学修饰的调控等。早期胚胎发育从受精卵开始主要消耗输卵管内的丙酮酸,进行氧化磷酸化提供能量。发育到囊胚阶段则主要利用子宫内的葡萄糖进行氧化磷酸化和糖酵解提供能量,同时也增加了氧的消耗。随后,胚胎植入到缺少氧气的子宫壁中,糖酵解过程将占据主导地位,此阶段几乎所有的丙酮酸都转变为乳酸。最后到胚胎器官生成阶段逐渐增加氧化磷酸化并与糖酵解达到一个动态平衡的状态。早期胚胎发育中糖代谢类型的转变以及产生的糖代谢中间产物都与胚胎发育有着密切的关系。糖代谢中关键基因之一,丙酮酸激酶(PK)参与糖酵解过程的最后步骤,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成丙酮酸。编码PK的基因包括丙酮酸激酶M型(Pkm)和丙酮酸激酶LR型(Pklr),每个基因又可以产生两种不同亚型。PKM蛋白的两种不同亚型PKM1和PKM2蛋白具有不同的催化活性。为了研究Pkm1和Pkm2基因在哺乳动物发育过程中的作用,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术高效快速构建Pkm1和Pkm2基因敲除小鼠。首先,通过张锋实验室sgRNA设计网站选择合适的sgRNA序列,并在胚胎上检测切割效率选取最佳sgRNA序列。然后,体外转录出Cas9 mRNA和靶向sgRNA,之后通过显微注射技术将两种RNA注射到C57/B6的受精卵中。随后将获得的受精卵体外培养至2细胞阶段之后,移植到ICR代孕母鼠的输卵管中,20天后检测新生小鼠基因型,成功获得Pkm1和Pkm2基因单独敲除小鼠。我们发现纯合敲除Pkm1或者Pkm2基因对小鼠都是致命的,但死亡时间不同。Pkm1基因敲除小鼠出生后陆续死亡,最长只能活到第六天,并且主要死亡时间在第五天和第六天。另外,通过Pkm1基因杂合敲除小鼠自交,子代中获得的纯合敲除小鼠的比例不足四分之一,说明可能发生了胚胎期死亡。另一方面,通过Pkm2基因杂合敲除小鼠自交,子代中没有得到Pkm2基因纯合敲除小鼠,说明纯合小鼠胚胎期致死。通过对不同时期胚胎分离鉴定,发现纯合小鼠不能正常发育到6.5dpc(days postcoitum)。由于Pkm1基因在心脏和脑组织中高表达,首先利用苏木精伊红染色(HE染色)对小鼠各组织做出初步的形态学诊断,结果发现Pkm1基因敲除小鼠心脏和脑组织都发生了明显病变。另外,我们发现成年的Pkm2基因杂合敲除小鼠睾丸有明显异常。同时我们对Pkm2基因杂合敲除小鼠肝组织(Pkm基因在肝组织中高表达)进行代谢相关基因转录水平检测,发现葡萄糖转运蛋白(Glut1,Glut4)、磷酸果糖激酶(Pfkm)、己糖激酶(Hk2)等糖酵解相关基因表达量都有明显上调;异柠檬酸脱氢酶(Idh1)、柠檬酸合成酶(Cs)等氧化磷酸化相关基因表达量都有明显下调。随后我们检测了小鼠胚胎干细胞系(mESC)中Pkm基因的表达情况,在mESC中主要表达Pkm2基因,而Pkm1基因表达量则很低,这与成体肌肉组织中结果正好相反。由于Pkm1基因和Pkm2基因敲除胚胎都能发育到囊胚阶段,因此我们尝试建立Pkm1基因和Pkm2基因敲除小鼠mESC,发现Pkm2基因敲除后不能成功建系。但是,我们在Pkm2基因杂合敲除的mESC中检测到Pkm1基因和Pkm2基因转录水平均有下降,这种变化趋势与Pkm2基因杂合敲除小鼠组织中的结果一致,具体机制有待进一步阐明。Pkm基因参与的糖代谢过程与小鼠发育有密切关系。通过对Pkm1和Pkm2基因敲除小鼠初步研究,发现Pkm基因对小鼠发育是至关重要的。但是Pkm1和Pkm2发挥作用的时间和功能可能存在差异,所以Pkm1和Pkm2在早期胚胎发育过程中的机制需要进一步研究。