论文部分内容阅读
当前,人类对优质蛋白源的需求日益增长,这大力地推动了水产养殖业和饲料行业的蓬勃发展。但与此同时,在水产养殖中也有很多实际问题日益凸显。其中,养殖鱼类体内脂肪过度沉积是当前普遍出现的营养性病症,它不仅严重制约着水产养殖业的健康发展,也对水产品安全造成潜在的威胁。因此,了解鱼类脂肪沉积的原理,并展开相关工作,是当前鱼类营养学研究的热门领域。本论文试图从内分泌代谢调控的角度,以斑马鱼为模型,探讨内分泌因子Ghrelin对斑马鱼脂肪沉积调控的机制,为更深入地理解鱼类脂肪沉积机理提供依据。本研究采用TALENs基因编辑技术敲除Ghrelin基因的斑马鱼纯合体为实验动物(来自中国科学院水生生物研究所),运用营养学、生物化学、分子生物学、转录组学等相关技术方法,探讨Ghrelin基因对斑马鱼脂代谢的影响。我们在得到Ghrelin基因突变的斑马鱼纯合体(Ghrelin-/-)后,首先进行繁殖工作,来为后续的养殖实验培育出不同生长阶段且足够数量的斑马鱼。之后的工作分为以下几个方面:一.确定Ghrelin-/-斑马鱼幼鱼表型。具体实验包括:运动行为学的监测,用荧光染料标记的草履虫进行投喂实验,针对生长激素(GH)表达量的原位杂交实验;二.在正常饵料投喂下,观察Ghrelin-/-斑马鱼成鱼表型。具体实验包括:将日龄均为10dpf、大小相同的野生型斑马鱼(WT/对照组)和Ghrelin-/-斑马鱼各10条放在同一水族缸中,设置三个平行处理,每天饱食投喂,混合喂养8周,实验结束后剪尾筛鱼测定相关指标;三.在高脂肪添加水平的饲料投喂(High Fat Diet,HFD)下,观察Ghrelin-/-斑马鱼成鱼表型。具体实验包括:将日龄均为45dpf,两种不同基因型的斑马鱼分开养殖8周,并分别定量(体重的4%)投喂不同脂肪添加水平(正常脂水平:7%;高脂水平:13%)的饲料。四个处理组分别为:Ghrelin-/-高脂组、Ghrelin-/-正常脂组、WT高脂组、WT正常脂组,每组设置三个平行处理。每周对各缸斑马鱼进行称重,养殖实验结束后采集组织样品,并测定相关指标。最后,从高脂饲料投喂组的斑马鱼肝脏中提取RNA,进行转录组测序分析。关于Ghrelin-/-斑马鱼幼鱼的实验结果包括以下几个部分:1)用荧光染料ASP对草履虫进行染色,而后投喂给日龄为5dpf且未开口的两种基因型的斑马鱼幼鱼,在30min分钟内,发现Ghrelin-/-斑马鱼消化道内的荧光面积及强度要显著高于对照组,说明其摄食量要高于野生型斑马鱼幼鱼。2)运动行为学的检测结果表明,Ghrelin-/-斑马鱼在日间运动活跃,且活跃程度要显著强于对照组,而在夜间没有明显差异。3)在原位杂交实验中,两种基因型斑马鱼幼鱼垂体中的生长激素(GH)含量接近,没有显著差异,说明Ghrelin作为生长激素促分泌素受体(GHSR)唯一的内源性配体,其缺失并没有直接影响斑马鱼幼鱼中GH的表达量。总的来说,幼鱼实验表明,Ghrelin在斑马鱼幼鱼上至少表现出两项生理功能:维持斑马鱼幼鱼的正常摄食行为与神经调节的运动行为。成鱼实验结果中包括三个部分:1)在混养实验中,两种基因型斑马鱼的存活率、平均体重、肝体比、脏体比均没有显著差异;WB(Western blot)结果显示,两种基因型斑马鱼垂体中生长激素的蛋白表达量没有显著差异;全鱼总蛋白和总脂肪均没有显著差异;而Ghrelin-/-斑马鱼的快速运动距离及耗氧量显著高于对照组,这表明其代谢水平较高,Ghrelin的缺失对斑马鱼整体代谢水平产生了影响。以上结果表明两种基因型的斑马鱼成鱼在同样的生长环境下,其生长表型类似,推测在敲除Ghrelin基因后,斑马鱼体内可能产生相应的补偿效应来弥补Ghrelin功能的缺失。2)在不同脂肪添加水平(7%,13%)饲料的投喂下,两种基因型斑马鱼的存活率、饲料系数、脏体比等指标均没有显著差异。在同样的饲料投喂组,Ghrelin-/-斑马鱼的饵料系数有小于对照组的趋势,说明其饲料转化率可能更高。增重率结果显示,在高脂饲料组,Ghrelin缺陷型斑马鱼的增重率要高于野生型斑马鱼,其他各组间差异不显著。肝体比结果显示,高脂饲料投喂组的野生型斑马鱼显著高于正常脂饲料组的野生型斑马鱼,其他各组间无显著差异。耗氧率(呼吸率)方面,四个处理组之间两两比较均有显著性差异,其中在正常脂饲料组,Ghrelin-/-斑马鱼耗氧率要显著高于野生型斑马鱼,在高脂饲料组亦如此;而高脂组野生型斑马鱼的耗氧率要高于正常脂组野生型斑马鱼的耗氧率,高脂组Ghrelin-/-斑马鱼的耗氧率要低于其在正常脂组的耗氧率。推测可能是由于:正常斑马鱼通过提高呼吸率来应对高能营养的摄入,而Ghrelin-/-型斑马鱼在应对高脂饲料刺激时,其代谢紊乱,能量内稳态失衡,呼吸率反而下降,并导致过多的能量储存在体内。对于实验用鱼体成分的测定显示:在高脂组,Ghrelin-/-斑马鱼的全鱼总蛋白含量要显著低于野生型斑马鱼,而后续转录组数据确实显示Ghrelin-/-斑马鱼的整体蛋白代谢水平较高。全鱼总脂数据显示:高脂组Ghrelin-/-斑马鱼的总脂要显著高于其他各组,而其他三组之间并无显著差异。对肝脏和肌肉中的TG含量进行检测,结果显示:在肝脏组织中,高脂饲料组Ghrelin-/-斑马鱼的TG的含量要显著高于其他各组,而其他三组之间没有显著性差异;在肌肉组织中,正常脂饲料组Ghrelin-/-斑马鱼TG含量要显著高于对照组,在高脂饲料组中亦如此。肝脏组织的油红切片结果显示,在两种饲料处理组中,Ghrelin-/-斑马鱼的脂滴含量均显著高于野生型斑马鱼。以上结果说明,Ghrelin-/-斑马鱼被投喂高脂饲料时,其体内更容易沉积脂肪。3)从高脂饲料处理组的斑马鱼肝脏中提取RNA,进行转录组测序分析。测序结果显示:在两个处理组中,与三大代谢相关的且有差异的二级通路里,脂代谢相关通路占到19.995%,糖代谢相关通路占到19.995%,蛋白代谢相关通路占到60.01%。为了更直观的展示两个处理组中各重要基因的表达情况,特绘制了相关分子通路图。结果显示,高脂饲料处理后,Ghrelin-/-突变体斑马鱼与野生型斑马鱼相比,其与脂肪合成代谢相关的基因显著上调,如FAS,DGAT1b等,而与脂肪分解代谢相关的关键基因显著下调,如CPT1,ACSL,ACADS,ACADL;三羧酸循环、糖酵解、糖异生等相关代谢通路受阻;蛋白代谢水平显著上调,表现为mTOR整体水平的上调。综上所述,本文研究结果表明,Ghrelin对维持斑马鱼幼鱼正常摄食和正常行为活动起着十分重要的作用。Ghrelin敲除的斑马鱼在正常饵料投喂下表型正常,这说明鱼类本身对Ghrelin基因的敲除具有一定的补偿机制,能够维持其基本代谢水平。而在高脂饲料的投喂下,Ghrelin-/-斑马鱼代谢异常,不能同野生型斑马鱼一样及时地调整代谢模式以应对高能摄入,从而说明:在应对高脂摄入的情况下,Ghrelin对于维持斑马鱼代谢稳态起到了重要作用。