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目的:研究99Tcm标记的新型RGD环肽二聚体99Tcm-联肼尼克酰胺-3聚乙二醇-甘氨酸-天冬氨酸环肽二聚体(99Tcm-HYNIC-3PEG4-E[c(RGDf K)2],简称99Tcm-3PRGD2)作为整合素αvβ3受体显像剂,监测临床化疗药物顺铂联合紫杉醇与抗新生血管生成的靶向治疗药物贝伐珠单抗对荷人卵巢癌SKOV3裸鼠模型治疗前后的效果,探讨99Tcm-3PRGD2显像用于肿瘤早期影像诊断及评价药物治疗疗效的可行性。方法:以联肼尼克酰胺(HYNIC)作为螯合剂,引入聚乙二醇(PEG4)分子合成新型RGD(Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)环肽二聚体HYNIC-3PEG4-E[c(RGDf K)2](3PRGD2)。加入三羟甲基甘氨酸(Tricine,N2[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine)和三苯基膦三间磺酸钠(TPPTS,trisodium triphenylphosphine-3,3’,3’’-trisulfonate)作为协同配体,对3PRGD2进行99Tcm标记获得分子探针99Tcm-3PRGD2;用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)鉴定其标记率。通过静置贴壁法培养整合素αvβ3受体高表达的人卵巢癌SKOV3细胞,收集对数生长期细胞,用RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)培养液制成单细胞悬液,1×107个细胞/0.2ml/只,注射于荷瘤裸鼠的右前肢外侧皮下,制备荷人卵巢癌SKOV3裸鼠模型。取15只荷瘤裸鼠,按随机数字表法将其分为三组(每组各5只),(1)对照组:给予200ul的生理盐水,(2)顺铂紫杉醇组:给予药物剂量顺铂3mg/kg、紫杉醇20mg/kg,(3)贝伐珠单抗组:给予药物剂量5mg/kg;体积均为200ul,各组均为腹腔给药,每周两次,连续三周。治疗期间定期观察荷瘤裸鼠状态,每隔4d测定裸鼠的体重、移植瘤体积变化。各组荷瘤裸鼠分别在治疗前、治疗后第15d、22d尾静脉注射99Tcm-3PRGD2,注药2h后行SPECT静态显像,观察肿瘤部位放射性浓聚的变化,应用感兴趣区技术(ROI)测定每个时间点肿瘤部位放射性计数与对侧正常部位同等区域放射性计数的比值(target to nontarget ratio,T/NT),并比较各组组内及组间显像的差异。治疗后第22d显像结束后,颈椎脱臼处死各组荷瘤裸鼠,取出肿瘤组织块,观察肿瘤组织大体形态,制成蜡块,分别对各组肿瘤组织进行免疫组化分析,观察肿瘤组织治疗后αvβ3表达情况;HE染色观察肿瘤细胞形态学变化。对各实验组治疗第22d荷瘤裸鼠99Tcm-3PRGD2体内显像T/NT比值与相应肿瘤组织αvβ3表达水平进行相关性分析,分析99Tcm-3PRGD2在分子显像与治疗疗效评价中的价值。采用SAS 9.1统计学软件对实验数据进行统计学分析,符合正态分布的计量资料数据应用均数±标准差(x±s)表示;各实验组组内比较采用单因素方差分析,组间比较采用两样本t检验或Wilcoxon秩和检验;T/NT比值与肿瘤组织整合素αvβ3表达水平的相关性采用Spearman等级相关分析;以P<0.05表明差异有统计学意义。结果:经RP-HPLC法测定,99Tcm标记的3PRGD2放射峰及紫外峰均为单峰,放射峰保留时间约为15.3min,标记率为(95.52±1.06)%(n=6)。对阴性对照组、顺铂紫杉醇组及贝伐珠单抗组中荷瘤裸鼠进行相应治疗,在治疗结束后,将各组荷瘤裸鼠处死,观察肿瘤形态大体变化,各组荷瘤裸鼠移植瘤体积在治疗期间均增大,但顺铂紫杉醇组及贝伐珠单抗组移植瘤体积生长缓慢,差异有统计学意义(F=448.034,P=0.000,P<0.05);而顺铂紫杉醇组及贝伐珠单抗组移植瘤体积未见明显统计学差异(t=0.417,P=0.761,P>0.05)。各组荷瘤裸鼠体重在治疗期间均逐渐增加,但治疗结束后未见明显统计学差异(F=2.288,P=0.144,P>0.05)。阴性对照组、顺铂紫杉醇组及贝伐珠单抗组分别于治疗前、治疗后第15、22d行99Tcm-3PRGD2 SPECT显像。荷瘤裸鼠分子显像结果显示,治疗前各实验组荷瘤裸鼠肿瘤部位均可见放射性核素浓聚,治疗后顺铂紫杉醇组与贝伐珠单抗组肿瘤摄取程度逐渐减低,而对照组放射性浓聚程度较治疗前稍增加。以注射显像剂后2h时的T/NT比值进行统计学分析,治疗第15d时顺铂紫杉醇组、贝伐珠单抗组T/NT比值均低于治疗前(Z=-6.066,-6.066,P=0.000,0.000,均P<0.05);治疗第22d时顺铂紫杉醇组、贝伐珠单抗组T/NT比值均低于治疗第15d时(Z=-2.098,-6.067,P=0.036,0.000,均P<0.05)。对照组在治疗第15d、22d时T/NT比值3.75±0.40、3.78±0.39均较治疗前T/NT比值3.70±0.36轻度增加,但无统计学差异(F=0.31,P=0.7337,P>0.05)。顺铂紫杉醇组与贝伐珠单抗组治疗第15d时T/NT比值分别为2.78±0.18、2.75±0.08,差异无统计学意义(Z=-1.6026,P=0.1090,P>0.05);治疗第22d时T/NT比值分别为2.64±0.22、1.61±0.21,差异有统计学意义(Z=6.0554,P<0.0001)。与治疗第15d时相比,治疗第22d时贝伐珠单抗组T/NT比值比顺铂紫杉醇组降低程度更为显著。显微镜下观察HE染色切片,对照组境界清楚,肿瘤细胞密度较高,形态完整,有明显的核异型和活跃的核分裂相,并见肿瘤新生血管生成;与对照组相比,顺铂紫杉醇组肿瘤细胞密度减小,组织呈片状坏死,镜下见片状或多灶性细胞凋亡,伴炎性细胞浸润;贝伐珠单抗组肿瘤细胞密度明显减小,核分裂相明显减少,肿瘤细胞核固缩、裂解,仅残存少量肿瘤细胞及细胞碎片。免疫组织化学检测结果显示卵巢癌肿瘤细胞和新生血管内皮上均有整合素αvβ3的表达,治疗后22天肿瘤组织整合素αvβ3表达检测结果:阴性对照组5例均表现为强阳性(+++);顺铂紫杉醇组阳性2例,弱阳性3例;贝伐珠单抗组弱阳性1例,阴性4例。治疗后顺铂紫杉醇组与贝伐珠单抗组αvβ3表达水平均较阴性对照组明显降低,差异有统计学意义(Z=-2.694,-2.668,P=0.007,0.008,均P<0.05);顺铂紫杉醇组与贝伐珠单抗组两治疗组组间αvβ3表达水平经分析,有统计学差异(Z=-2.394,P=0.017,P<0.05)。分析顺铂紫杉醇组与贝伐珠单抗组体内显像T/NT比值和相应整合素αvβ3表达的相关性,结果显示,相关系数分别为rs1=0.950,P=0.013<0.05;r=0.914,P=0.030<0.05。结论:1 99Tcm-3PRGD2标记率高,能够被整合素αvβ3高表达的卵巢癌肿瘤组织摄取,表明99Tcm-3PRGD2可用于整合素αvβ3阳性肿瘤的特异性影像诊断;2顺铂紫杉醇组与贝伐珠单抗组治疗后荷瘤裸鼠移植瘤对99Tcm-3PRGD2的摄取降低,T/NT比值下降,并与相应肿瘤组织整合素αvβ3表达水平的降低呈良好的正相关;99Tcm-3PRGD2显像可探测卵巢癌肿瘤组织中整合素αvβ3受体的表达水平,并可无创评估卵巢癌药物的疗效。