神经细胞粘附分子(NCAM)作为膜表面糖蛋白的一类，属于细胞粘附分子免疫球蛋白超家族，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的粘附作用，主要表达于神经系统，在正常神经元轴突的生长、突触的可塑性、神经纤维的成束及学习和记忆等过程中起重要作用，影响神经系统的可塑性。以往研究已经证实，NCAM参与的神经活动的多个过程与铅神经毒性机制涉及的几个方面有关，这提示干扰NCAM的正常表达可能是铅的神经毒机制之一。NCAM在人脑内，主要以NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120三种亚型(其分子量分别为180、140、120KD)表达。NCAM-180、NCAM-140属跨膜糖蛋白，两者通过跨膜区与胞内细胞骨架连接便于信号转导，NCAM-180的胞质区比NCAM-140的含氨基酸残基多，NCAM-120无胞质区及跨膜区，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)直接与膜相连，易于在膜表面运动，且只锚定于膜上的脂筏区域。NCAM三种亚型在神经生长发育中的表达、功能和胞内信号传导的过程有所不同，这可能与它们存在的结构差异有关，但其结构与功能的具体关系目前研究还不多，还有待进一步研究。本研究拟通过基因工程技术建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120三种亚型各自的高表达细胞模型，并初步探索低剂量铅对三种NCAM亚型表达的影响，为进一步探索铅的神经发育毒性机制与NCAM的神经发育调节机制的关系打下基础。　　 研究目的：　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120三种亚型各自的高表达细胞模型。　　 2初步探索低剂量铅作用对NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表达的影响。　　 研究内容与方法：　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表达细胞模型转染方法的探索：对lipofactaneTM2000、磷酸钙和FuGENE(R)HD Transfaction Reagen三种试剂的转染效果进行比较，并优化有关转染条件。分别用此三种方法对HEK-293细胞转染绿色荧光蛋白表达质粒(PMIG-GFP)，其中lipofactaneTM2000设DNA(μg)：lipofactaneTM2000(μl)为1∶1.25、1∶2.5、1∶3.75三种比例，FuGENE(R)HD TransfactionReagen设质DNA(μg)：FuGENE(R) HD Transfaction Reagen(μl)为2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8六种比例进行转染，显微镜下观察转染后48小时细胞荧光蛋白的表达情况以比较此三种方法的转染效果。　　 2.NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表达细胞模型的建立：拟建立SH-SY5Y细胞和HEK-293细胞的NCAM亚型高表达模型，对SH-SY5Y细胞和HEK-293细胞分别转染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120质粒，并使用免疫荧光和Western blot方法检测转染后蛋白表达的情况，以判断高表达细胞模型的建立的结果。　　 3.低剂量铅作用对NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表达的影响：以低浓度PbCl2对成功建立的高表达细胞模型进行染毒，用Western blot方法检测NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120蛋白表达情况。　　 研究结果：　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表达细胞模型转染方法的探索　　 1.1在FuGENE(R) HD Transfaction Reagen转染中，当DNA(μg)：FuGENE(R) HDTransfaction Reagen(μl)为2∶6和2∶7时的转染率较高，均可达80％以上。　　 1.2在lipofactaneTM2000转染中，DNA(μg)：lipofactaneTM2000(μl)为1∶2.5和1∶3.75时的转染率较高，均可达50％～60％，比例为1∶3.75时转染试剂对细胞的毒作用较大，转染过程中产生的死细胞较多。　　 1.3三种试剂对HEK-293细胞进行PMIG-GFP质粒的转染中以FuGENE(R)HDTransfaction Reagen2∶6和2∶7的比例时的转染效率较高，且细胞毒性较少，在转染过程中罕见细胞死亡，细胞形态、生长状态均保持良好。　　 2.NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表达细胞模型的建立　　 2.1以lipofactaneTM2000和FuGENE(R) HD Transfaction Reagen对SH-SY5Y细胞转染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120重组质粒，检测转染48h后蛋白表达情况，经免疫荧光与Western blot法检测，结果显示无NCAM亚型蛋白高表达。　　 2.2以FuGENE(R) HD Transfaction Reagen对HEK-293细胞转染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120重组质粒，检测转染48h后蛋白表达情况，Western blot检测结果显示HEK-293细胞经转染后可高表达NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120蛋白。　　 3.低剂量铅作用对NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表达的影响　　 3.1本研究选取1μM和10μM PbCl2作用于NCAM-180高表达HEK-293细胞，结果显示染毒12h后两个剂量组的蛋白表达均比对照组降低，而染毒24h后蛋白表达降低得更为明显；且无论是染毒12h还是24h，10μM Pb2+比1μM Pb2+蛋白表达降低得更为明显。　　 3.2在对NCAM-140高表达HEK-293细胞的作用中，12h作用后1μM与10μM组均较对照组NCAM-140表达要减少，而1μM与10μM组间表达相差不大，经24小时作用后1μM与10μM组NCAM-140表达较对照组更明显降低，且10μM组比1μM组的降幅明显要更大。　　 3.3在对NCAM-120的影响实验中，12h作用后铅1μM与10μM组的表达量较对照组略有降低，而此降幅不如对NCAM-180和NCAM-14012h作用时明显。经24h作用后两染毒组NCAM-120表达量较对照组明显下降，降幅较12h作用时大，且10μM组的蛋白表达降低得更为明显。　　 结论：　　 1.从转染后蛋白表达情况看，本实验建立的HEK293细胞转染模型能够高表达NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120。　　 2.实验结果显示，低剂量铅对NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120的表达均有抑制作用。实验结果提示这种抑制作用有时间效应和剂量效应趋势，且相对NCAM-140、NCAM-120而言，低剂量铅对NCAM-180的抑制程度可能要更显著。