蚓激酶基因在奶牛乳腺中表达的研究

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:linjr82
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本试验构建了重组逆转录病毒载体,旨在对其包装获得重组病毒,为最终获得其转基因奶牛乳腺生物反应器提供依据。 首先,将含有山羊β-酪蛋白基因(β-casein)5’区调控序列(BCP)、蚓激酶基因(lumbrokinase)以及牛生长激素基因polyA(BGHpolyA)序列的表达盒克隆到骨架为Moloney小鼠白血病病毒(缺失基因组)、含有标记基因NeoR的逆转录病毒载体pLNCL中,构建了蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LKR。以生理盐水为溶剂,将质粒转染泌乳期奶牛乳腺小叶,收集不同时段奶样,采用纤维蛋白平板溶圈法(FibrinAgarosePlateAssay,FAPA)检测其纤溶活性,结果显示,BCP作为乳腺特异性启动子能指导目的基因即蚓激酶基因在奶牛乳腺组织实现有效表达。 以脂质体为转染剂,转染包装细胞PA317,对pLN-BCP-LKR质粒进行包装,得到了PI、P2、P3、P4、P5五株可持续产生病毒颗粒的细胞克隆。通过体外感染NIH3T3细胞测定各产毒细胞株病毒的感染滴度,通过比较,由产毒细胞株P2所产生的重组逆转录病毒感染滴度最高,达到1×104CFU/ml。将病毒1~3次转染妊娠期奶奶牛乳腺,每次10~15ml,待产犊后采集奶样检测目的基因表达情况。FAPA检测结果显示,蚓激酶在乳腺组织中实现了稳定的表达。 将表达目的蛋白的奶样经SDS-PAGE凝胶电泳检测,结果显示:表达的蚓激酶分子量约为40kDa。
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