高血脂症(Hyperlipidemia)是指脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常。高血脂症常表现为血中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低,现代医学称之为血脂异常。脂质不溶或微溶于水,必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在,常伴随血清脂蛋白浓度升高。高脂血症的临床表现主要是脂质在真皮内沉积所引起的黄色瘤和脂质在血管内皮沉积缓慢进展为动脉粥样硬化。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种累及主动脉、肾动脉、冠状动脉、脑动脉、下肢动脉等大中型动脉的病变,其特征为动脉内膜上有黄色粥样的脂质沉积、血栓形成、纤维组织增生、动脉中层钙化等多种病变,甚至引起血管管壁增厚变硬、管腔堵塞,使受阻动脉远端缺血而导致局部组织坏死。AS是心血管系统最常见的疾病之一,可累及全身重要器官。如冠状动脉粥样硬化可引起心绞痛、心律失常等,脑动脉粥样硬化可引起脑缺血产生头晕头痛,下肢动脉粥样硬化可导致下肢间竭性跛行等。随着社会的发展和人们生活水平的不断提高,动脉粥样硬化所导致的并发症和死亡率迅速增多,目前已成为全球人口死亡的首位原因。因此,AS已成为医学研究的重点和热点领域。AS的特征之一是粥样斑块中存在含脂类的泡沫细胞,泡沫细胞主要来源于巨噬细胞。近年来大量研究表明,氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)对泡沫细胞的形成起重要的诱导作用。天然低密度脂蛋白(LDL)的核心含有大量不饱和脂肪酸,在自由基、活性氧等氧化剂的作用下,经过一系列反应,成为化学修饰的LDL,包括乙酰化LDL、4-羟烯酸直接结合的LDL及ox-LDL等。巨噬细胞摄取化学修饰的LDL由清道夫受体识别和代谢,不受细胞内胆固醇含量的调节,可导致细胞大量摄取化学修饰的LDL,引起细胞内脂质沉积,形成泡沫细胞。目前认识较多的是 ox-LDL。降低血浆的高脂状态和抵抗血管脂质的过氧化是预防和减轻动脉粥样硬化的一个重要手段。目前治疗动脉粥样硬化的方法主要是健康的生活方式、适量的体育运动及对症治疗等,如血脂调节药(辛伐他汀、非诺贝特等)、不饱和脂肪酸、抗氧化剂(维生素C、维生素E、β-胡萝卜素及普罗布考等)、内皮细胞保护药(硫酸多糖,藻酸双酯钠等)、中药(决明子、山楂、丹参等)。AS是全球性健康问题,至今仍没有非常有效的治疗方法,开发真正有效防治AS的药物,已经是当前迫切需要解决的问题。细胞珠蛋白(Cytoglobin,CYGB)是新发现的一类含血红素的六配位蛋白(hexacoordinate globinsuper-family,hxHb)中的一员,其在动物、细菌、植物中表达。CYGB的晶体结构显示,像其他hxHb一样,尽管有高配体亲和力,其配体结合的调控机制完全不同于血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)那样经典的五配位血红素蛋白。Hb和Mb的生理功能如携氧和呼吸能力早已被明确定义了,而CYGB的生理功能还不是很清楚。CYGB在哺乳动物中广泛表达在肝脏、心脏、肠、肾脏、肺和胰腺的成纤维细胞和成纤维样细胞的包浆中。CYGB有可逆性地结合02、NO和CO的能力。CYGB选择性地过表达在氧化应激应答区,如海马、丘脑、下丘脑。CYGB被推测参与氧气传输、储存和传感等,产生胶原和对细胞的氧化应激和缺氧的应答。CYGB mRNA在细胞缺氧状态下表达增加,而且CYGB的水平在肝脏、胰腺、肾脏的成纤维细胞激活后上调。CYGB可被H2O2特异性地的调高,当用siRNA干扰CYGB的基因表达时,氧化应激导致的细胞失活率增加。越来越多的证据表明CYGB会在组织损伤的时候大量产生,成为有效的活性氧清道夫。在分子水平,CYGB可充当NO双氧化酶,清除过多的NO。NO是由一氧化氮合酶和亚硝酸盐动员产生,在脉管中有着非常重要的作用,如NO可作为第二信使,调节血管内皮细胞的舒缩功能,抑制LDL氧化。但是当ox-LDL被巨噬细胞大量吞噬,发生氧化应激,细胞内会产生大量的氧化产物,如ROS、NO、MDA等,造成细胞损伤,诱导泡沫细胞的凋亡。体内及体外实验表明外源性过表达重组人源细胞珠蛋白(rhCYGB)可保护肝星状细胞免受氧化应激损伤并且抑制肝纤维化中细胞向纤维样细胞分化。氧化应激也是造成动脉内皮损伤而致动脉粥样硬化的主要原因,我们推测rhCYGB的抗氧化能力和协同脂质代谢蛋白起到降脂的作用,会有利于治疗动脉粥样硬化。本实验分三部分:第一部分:rhCYGB治疗大鼠高血脂的疗效。实验所用的rhCYGB是通过本实验室已构建好的PET28a-rhCygb-BL21(DE3)工程菌制备得到,涂kan+LB培养板,挑选单克隆菌株,大量摇菌,裂菌,用G25的分子筛复性,再用亲和层析柱纯化,然后用PBS透析,Millipore4ml、3K浓缩管进行离心浓缩,最后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。复性及纯化后的rhCYGB进行SDS-PAGE蛋白电泳,用BandScan 5.0软件对凝胶电泳图进行灰度分析,计算纯化后的rhCYGB纯度。同时采用T-AOC试剂盒检测纯化后的rhCYGB抗氧化生物活性。亲和层析纯化后的rhCYGB纯度为93%左右,并且纯化后的rhCYGB抗氧化活性为95U/mg左右。动物实验采用雄性SD大鼠50只按完全随机方法分为2组,正常对照组10只,造模组40只。40只造模组的大鼠在4周造模成功后,随机选取10只采用尾部静脉采血测量血脂四项(TG、TC、LDL-C、HDL-C),测量结果证实造模成功;40只大鼠随机分为3mg/kgrhCYGB治疗组(8只)、6mg/kgrhCYGB治疗组(8只)、9mg/kgrhCYGB治疗组(8只)、阳性药(藻酸双酯钠,ASD)治疗组(8只)、高脂模型组(8只)。分别给予藻酸双酯钠6mg/(kg.d)剂量和rhCYGB 3mg/kg、6rmg/kg、9mg/kg的剂量皮下注射,1次/2天,共治疗1个月。在实验期间持续投喂高脂饲料。实验结束后进行大鼠肝组织病理切片,用Abbott AerosetTM生化分析仪检测TC、TG、HDL-C及LDL-C浓度。细胞实验选用人HepG2细胞株,使用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基接种于6孔板中培养,待细胞长到70%的聚合度时,分组为正常对照组、油酸(Oleic acid)组(仅用0.6mmol/L的油酸处理)、ASD组(0.6mmol/L的油酸加11-μg/ml藻酸双酯钠)、rhCYGB组(分别为0.6mmol/L的油酸加不同剂量的rhCYGB(5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL)共同处理)。各组细胞在不同处理因素下作用72h后,收集细胞做检测。每次实验每组分别设3个复孔,实验重复3次。用油红O做细胞染色,并用HPLC测量细胞内甘油三酯含量,用试剂盒测量细胞内MDA含量和GPx、SOD的活性。结果显示,用高脂饮食成功造出大鼠高血脂模型,且9mg/kg rhCYGB治疗组的TC、TG及LDL-C的血浆浓度低于高脂模型组(P=0.000),接近正常对照组:HDL-C浓度较高脂组显著升高(P=0.000),有助于机体逆转运血中脂质。细胞实验结果也显示,15μg/mLrhCYGB组的细胞内油红O染色形成的红色脂滴最少(P<0.01),与正常对照组相近。细胞内TG及MDA含量测定结果也表明15μg/mL rhCYGB组的TG、MDA含量远远低于其他治疗组(P<0.01),GPx和SOD的活性显著高于其他治疗组(P<0.01)。结果表明rhCYGB有抑制细胞摄取脂质并促进脂质在细胞内的代谢,减少脂质在细胞内的堆积和抑制脂质过氧化所造成的损伤。高血脂症持续进展将导致脂质在动脉壁堆积,引起动脉损伤,进而可形成动脉粥样硬化。关于rhCYGB作用于高血脂症的初步研究为后面进行动脉粥样硬化的研究提供了思路。第二部分:rhCYGB治疗大鼠动脉粥样硬化的疗效和相关机制。动物实验采用雄性SD大鼠41只按完全随机方法分为2组,正常对照组8只,造模组33只。正常对照组投喂普通颗粒饲料,模型组投喂高脂饲料,并在高脂饮食的基础上,腹腔注射维生素D3,共70万IU/Kg,分4次,隔3天注射一次。造模4周。33只造模组的大鼠经历4周造模后,随机选取1只取主动脉做病理切片,HE染色,病理结果证实造模成功。32只造模组的大鼠随机被分为4mg/kgrhCYGB治疗组(8只)、7mg/kgrhCYGB治疗组(8只)、藻酸双酯钠治疗组(8只)、高脂模型组(8只)。皮下注射,1次/2天,治疗八周。正常对照组在整个实验期间持续投喂普通饲料,而rhCYGB治疗组、藻酸双酯钠治疗组及高脂模型组在整个实验期间均持续投喂高脂饲料。治疗后各组禁食12h,乙醚麻醉后腹主动脉采血并取组织样本,做病理切片。结果显示,7mg/kg rhCYGB治疗组的TG、TC、LDLC、Ca2+比正常对照组稍有升高(P<0.05),但相对于高脂组有显著降低,而HDLC较正常对照组和高脂组都有明显升高(P<0.01)。7mg/kg rhCYGB组的血管壁内膜不完整,中层弹力膜无明显破坏和钙化,相较于高脂组AS的情况有较大的好转。而且7mg/kg CYGB治疗组的内膜和中膜厚度及比值相较于高脂组明显降低(P P<0.01)。双向电泳结果显示有载脂蛋白E(apoE)、脂多糖结合蛋白(LBP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽硫转移酶((GSTs)等参与rhCYGB降脂抗氧化的作用通路中。血清荧光定量PCR结果rhCYGB上调了 AMPK和SOD的基因表达水平,而HMGCR和LDLr的表达水平受到抑制。因而rhCYGB是否结合相关氧化还原酶相关作用于AMPK作用通路,需进一步探究。第三部分:rhCYGB体外调节细胞脂质代谢和抗氧化机理选用人急性白血病单核细胞株THP-1,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基将THP-1接种于6孔板中培养,37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞计数并调整密度在1×106/ml,L将佛波酯(PMA)加入细胞悬液,使其终浓度为50ng/mL,转入六孔板,每孔加入2mL,静置培养72h。镜下观察THP-1细胞诱导分化为巨噬细胞后,分组:正常对照组(A);ox-LDL处理组:50μg/mL 的 ox-LDL 处理组(B);ox-LDL+rhCYGB 组(C):50×g/mL 的 ox-LDL 加不同剂量的 rhCYGB(5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL)处理;辛伐他汀处理组(D):50μg/mL 的 ox-LDL加 1μg/mL辛伐他汀。各组细胞在不同处理因素下作用24h后做检测。每次实验每组分别设2个复孔,实验重复3次。收集细胞用试剂盒做MTT实验,高效液相色谱法(HPLC)测量细胞内胆固醇含量,用试剂盒测量细胞内谷胱甘肽过氧化物酶GPx、丙二醛(MDA)、超氧化物酶(SOD)、NADPH氧化物酶含量,用荧光探针检测细胞内NO及ROS的荧光强度。结果显示,rhCYGB在剂量30μg/mL内对细胞无毒害作用。15μg/mLrhCYGB可降低细胞内的总胆固醇的含量(P<0.05),同时降低胆固醇酯与总胆固醇的比值(P<0.05),逆转泡沫细胞的形成。rhCYGB可降低细胞内MDA的含量,抑制NADPH氧化酶的活性,提高SOD、GPx的活性,降低细胞内ROS、NO的含量(P<0.01)。实验结果表明,rhCYGB能改善并逆转大鼠的动脉粥样硬化进程,而且比临床常用药藻酸双酯钠的效果更显著(P<0.01)。在体外细胞试验中,rhCYGB可一定程度上抑制ox-LDL对巨噬细胞的损害,降低细胞内的脂质,逆转泡沫细胞的形成,抑制氧化应激,阻止氧化物对细胞的进一步损伤。上述实验结果说明rhCYGB有很好的降血脂和抗动脉粥样硬化的效果,有望成为治疗高血脂和动脉粥样硬化的新药物。