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本课题组在前期研究中利用生物信息学手段初步明确了在玉米大斑病菌中存在4条MAPK级联途径,其中HOG-MAPK途径主要参与调控病菌的高渗胁迫反应。继而,克隆了玉米大斑病菌水甘油通道蛋白基因St FPS1,并利用RNAi及基因敲除技术初步阐明了基因的功能。本研究在此基础上,利用基因敲除技术再次创制St FPS1基因的2株敲除突变体,通过比较突变体与野生型菌株在生长发育、细胞壁发育及对高渗胁迫的反应,进一步明确该基因的功能。主要研究结果如下:1、获得了玉米大斑病菌St FPS1基因敲除突变体。验证了前期研究中构建的玉米大斑病菌St FPS1基因敲除载体,并将该载体转化玉米大斑病菌野生型菌株原生质体;利用潮霉素抗性筛选获得了2株表型稳定的抗性转化子;通过特异引物PCR、RT-PCR等技术证实了这2株抗性转化子为St FPS1基因敲除突变体。2、St FPS1基因影响玉米大斑病菌菌丝细胞的形态建成及分生孢子发育。与野生型菌株相比,St FPS1基因敲除突变体在PDA培养基上生长速度降低,菌丝细胞长度增加并出现弯曲膨大现象,几乎不产生分生孢子。表明,St FPS1基因不仅影响菌丝发育,也影响分生孢子发育。3、St FPS1基因参与玉米大斑病菌菌丝细胞的高渗胁迫反应。在高渗胁迫条件下,与野生型菌株相比,突变体菌丝细胞膨大;菌丝细胞内甘油含量显著增加;生长速率受抑制程度低,St FPS1基因敲除突变体对高渗胁迫条件的耐受力明显提高。表明,St FPS1基因参与病菌高渗胁迫反应,是一种调控因子。进一步检测外高渗胁迫条件下突变菌株中调控甘油合成的关键基因(St GPD1、St HOR2)的表达水平变化,发现2个基因的表达水平比正常培养条件下升高,但未达到野生型菌株中基因的表达水平。基于此,推测玉米大斑病菌中水甘油通道蛋白St FPS1的缺失、甘油的外排受阻是细胞甘油含量升高及突变体提高其耐受高渗胁迫条件的主要原因。4、透射电镜观察发现,与野生型菌株相比,St FPS1基因敲除突变体的细胞壁明显变薄;Real-time RCR技术分析发现突变体中细胞壁合成相关基因St CHS1、St CHS2、St CHS2、St Rho1的表达量均降低,且突变体对细胞壁合成干扰物质的敏感性降低。结果表明,St FPS1基因参与调控病菌细胞壁的形态建成。5、渗胁迫条件下,野生型和突变体菌株细胞壁均增厚,但突变体显著增厚。细胞壁合成基因(St CHS1、St CHS2、St CHS3、St Rho1)表达水平明显增加,表明在高渗胁迫条件下,细胞壁增厚是病菌耐受高渗胁迫条件的重要反应之一。6、玉米大斑病菌St FPS1基因对HOG-MAPK途径和CWI-MAPK级联途径均具有一定影响。本研究发现在St FPS1基因敲除突变体中HOG-MAPK和CWI-MAPK途径的关键基因St HOG1、St SLT2表达量均呈现显著下降。因此,St FPS1基因的缺失降低了St HOG1、St SLT2基因的表达水平,降低了细胞壁合成酶基因的表达水平,是细胞壁合成受阻,是胞壁变薄。7、玉米大斑病菌St FPS1基因参与病菌的氧胁迫及温度胁迫反应。