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造血干细胞是包括髓系细胞和淋系细胞在内的多种成熟血细胞的主要来源。小鼠胚胎发育过程中,造血干细胞主要起源于胚胎期第10.5天（embryonic day,E10.5）的主动脉-性腺-中肾区（aorta-gonad-mesonephros region,AGM）区,此时主动脉内皮经过内皮造血转化过程产生造血细胞。在该过程中,一小群特化的生血内皮细胞的形态逐渐由内皮细胞样的扁平转变为造血细胞样的圆形,并通过出芽的方式集结形成造血簇。簇中包含了造血干细胞前体,它们最终会发育为成熟造血干细胞并迁移至胎肝扩增,随后定植到骨髓。在胚胎造血干细胞发育过程中,由于缺乏特异性表面标志分子,一直无法精确捕获造血干细胞及其相关群体。我们前期研究筛选获得高特异性表面标志,结合单细胞诱导移植体系,首次在单细胞水平高效富集造血干细胞前体,并结合单细胞转录组测序,系统解析了造血干细胞发育全程的单细胞动态分子表达特征。本课题进一步挖掘造血干细胞发育全程的单细胞转录组数据,针对胚胎期早期内皮细胞、造血干细胞前体、胎肝和成体造血干细胞群体的单细胞分子表达特征进行分析,得到造血干细胞特化过程中表达上调的基因集合,从中筛选出从造血干细胞前体到造血干细胞阶段逐渐上调并显著高表达在造血干细胞中的Hlf基因（hepatic leukemia factor,Hlf）。新近研究显示Hlf分子特异性的表达在胎肝及成体造血干细胞中,提示Hlf分子亦可能特异性标记胚胎早期的造血干细胞前体和造血干细胞,为此我们构建了 Hlf-tdTomato荧光报告小鼠和Hlf-CrexER谱系示踪小鼠。我们针对新构建的Hlf-tdTomato荧光报告小鼠进行表达图谱的鉴定,组化染色结果显示:在E10.5 AGM区中共表达RUNX1和CD31的造血相关群体表达Hlf-tdTomato,而CD31+的内皮层细胞基本不表达Hlf-tdTomato。流式结果也表明,E10.5 AGM 区内皮细胞群体（CD31+CD41-CD43-CD45-）不表达 Hlf-tdTomato,造血簇（CD31+Kit+）中有超过40%的细胞表达Hlf-tdTomato;E11的AGM区中有接近40%的CD45-造血干细胞前体和几乎所有的CD45+造血干细胞前体都表达Hlf-tdTomato。我们进一步通过诱导移植实验发现:在E10.5的CD31+CD45+Kit+群体中,仅Hlf-tdTomato+亚群在诱导/移植后3到4周存在髓系和淋系重建,而CD31+CD45-Kit+群体中,Hlf-tdTomato+和 Hlf-tdTomato-亚群在移植后3到4周均出现髓系和淋系重建,表明Hlf表达能特异性富集功能性CD45+造血干细胞前体。此外,E11造血簇细胞（CD3 1+Kit+）进行体外孵育后的产物分析结果显示:只有Hlf+细胞能产生造血干细胞表型样的细胞。以上功能实验表明Hlf-tdTomato表达能进一步有效富集CD45+造血干细胞前体。继而,利用新构建Hlf-CrexER与ROSA26报告小鼠杂交,通过在早期胚胎发育的不同时间点进行诱导,对表达Hlf-CrexER的细胞群体进行谱系示踪,以探究早期胚胎Hlf-CrexER阳性细胞对胎肝各造血干祖细胞群体和成体外周血贡献的动力学变化。使用 Lin-Sca-1+Mac-1lowCD201+（LSM201）、CD45+CD201+CD48-CD150+（ESLAM）和 Lin-Sca-1+Kit+CD48.CD150+（LSKSLAM）的表面标志组合进行胎肝造血干细胞的分析,我们发现E8.5诱导后,胎肝造血干细胞基本未被标记上,而E9.5、E10.5、E11.5和E13.5诱导后,胎肝造血干细胞标记比例呈现逐步上升,尤其E9.5和E10.5诱导后,标记比例均值出现跃升。对诱导后出生的成年小鼠外周血各谱系标记比例的持续检测发现,E9.5诱导后外周血各谱系标记比例均值约2%,显著低于E10.5诱导后（约20%）,表明该时间段随着Hlf表达强度的逐渐上升,可能充分标记了 AGM区的造血干细胞前体及造血干细胞群体。因为AGM区造血干细胞前体及造血干细胞群体起源于内皮细胞,我们进一步通过Tie2-Dre与Hlf-CrexER进行交配得到组成型小鼠,再与ROSA26报告小鼠杂交,即可将Hlf标记更加特异性的限定在早期内皮细胞。通过胎肝造血干细胞检测,我们发现组成型小鼠在胎肝造血干细胞中的标记比例不如诱导型中E13.5中造血干细胞标记比例高,并且通过对出生后小鼠外周血各谱系示踪记录比较,发现组成型小鼠外周血各谱系标记比例也低于诱导型小鼠外周血各谱系的标记比例。总之,本研究通过单细胞转录组分析,筛选到在造血干细胞前体、胎肝造血干细胞和成体造血干细胞中特异性表达的Hlf分子,并构建了 Hlf-tdTomato荧光报告小鼠和Hlf-CrexER谱系示踪小鼠。通过荧光报告小鼠模型我们对胚胎早期造血干细胞前体进行了进一步标记分析,并利用谱系示踪模型揭示了不同发育时间点Hlf分子表达标记细胞的造血命运以及对胎肝造血干细胞贡献的动力学变化。并且构建的小鼠模型可与多种基因型小鼠联合使用,谱系示踪小鼠与Confetti小鼠的联合使用能对造血干细胞的起源异质性进行研究,利用荧光报告小鼠可以探究造血干细胞在骨髓微环境中的定位及其与其他分子间相互作用的机制,这对研究造血干细胞的起源及其应用具有重要的借鉴意义。