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喉癌为头颈部常见恶性肿瘤，占头颈部恶性肿瘤的35.4%，发病率居头颈肿瘤第三位。在所有诊断的癌症中，喉癌约占1％。不仅如此，近年来喉癌的发病率呈显著上升趋势。目前，在外科手术和放化疗联合治疗的情况下，患者的五年生存率仍没有提高，Tis、T1和T2期喉癌治疗有效率为80-90%，而T3、T4期只有40-50%。为保全喉功能、保证生活质量，化疗日益被人们所接受。然而，传统的化疗缺乏特异性，并会对正常组织产生副作用。除此之外，病变区用药量不足，治疗效果也不尽人意。目前，开发功能性纳米材料并将其应用于药物递送系统正成为癌症治疗中一个非常重要的研究领域。现已针对靶向给药和控制药物释放两方面，开发出多样的纳米药物递送系统，并在提高化疗药物的肿瘤部位积累和减少副作用两方面呈现出显著疗效。在所有药物载体的材料中，介孔二氧化硅纳米粒子(MesoporousSilicaNanoparticles，简称MSN)在高表面积和大孔体积方面特性显著，这就赋予了它在药物存储方面的特殊能力并且它的表面含有大量的硅羟基使其易于功能化，可以更好地控制载药量和药物释放。以介孔二氧化硅为基础的纳米容器配备了“守门员”，这点极具吸引力。通过采取变换“守门员”和观察刺激响应等策略优势，达到在特定时间内对特定部位进行有规律的给药。为实现有效的控释，选择与肿瘤相关的生物刺激是先决条件。由于糖酵解的缺氧诱导协同上调，将细胞内pH值进一步降低，在核内体（pH值=5.06.0）和溶酶体（pH值=4.05.0）中体现尤为明显，因此与正常组织和血液细胞外环境（pH值=7.27.4）相比，大多数实体瘤为弱酸性（pH值=6.07.0）。此外，某些特定恶性肿瘤的局部特征便是温度过高。基于以上的讨论，可以将pH值和温度作为的典型的生物刺激，应用于药物释放。【方法和结果】本实验通过制备具有叶酸靶向和pH/温度智能双响应控释二氧化硅纳米粒子的药物载体，负载化疗药顺铂后，通过体内和体外实验证明，这种药物载体能够增强顺铂诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的作用。一、叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子复合材料的制备及其性能检测(1)通过碱性催化溶胶－凝胶法，以摩尔比为1.0：8.16：2.55：4857的CTAB/TEOS/NaOH/H2O体系，制备出单分散的尺度为100nm的介孔二氧化硅纳米粒子。通过N2吸附/脱附测试表明所制材料的比表面积约为786m2/g，孔径分布约为约为2.5nm，低角度粉末X-射线测试进一步表明其具有六方的高度与有序的介孔孔道结构。(2)通过碳－碳双键的共价键相互作用将MPS修饰到介孔二氧化硅纳米粒子表面，形成MSN-MPS。再利用种子沉淀聚合作用将NIPAM和MA单体聚合，形成MSN@p(NIPAM-co-MA)复合纳米粒。低角度粉末X-射线及高分辨投射电镜测试表明该纳米复合粒子仍保持着完整的介孔结构。傅里叶变换红外（FTIR）光谱研究又进一步证实了NIPAM和MA已成功地被聚合到MSN纳米粒子上。动态光散射实验表明MSN@p(NIPAM-co-MA)不仅具有良好的分散性，而且其具有温度敏感响应特性。(3)通过叶酸（FA）中-NH2基团与MSN@p(NIPAM-co-MA)中的-COOH基团相互作用完成FA与MSN@p(NIPAM-co-MA)之间的嫁接。紫外—可见光谱（UV/Vis）及FTIR光谱测试表明FA成功嫁接到MSN@p(NIPAM-co-MA)纳米复合材料中。所制备的MSN@p(NIPAM-co-MA)-FA复合材料在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中具有良好的稳定性和分散性。(4)选用荧光素（FL）作为标记物通过光谱量化FL的实际负载水平，研究了药物负载及其对pH和温度双响应的控制释放行为。研究结果表明所制备的复合材料展现出良好的pH和温度的智能双响应：在高温低pH值的缓冲溶液中，其展现为高效快速的释放行为；在低温高pH值的缓冲溶液中，其展现为缓慢低速的释放行为。二、体外实验（1）MTT实验检测结果证实：1）浓度小于100μg/ml的叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子（MSN@p(NIPAM-co-MA)-FA）不会对喉癌Hep-2细胞的生长起到抑制作用。2）与含相同浓度梯度顺铂的单纯顺铂组和负载顺铂的pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子（cisplatin-loadedMSN@p(NIPAM-co-MA)）组相对比，负载顺铂的叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子（cisplatin-loadedMSN@p(NIPAM-co-MA)-FA）表现出更高的细胞毒性。(2)共聚焦扫描激光显微镜记录到叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子负载荧光剂的模型能够被喉癌Hep-2细胞成功摄取，并在细胞内的成功进行了药物释放。（3）通过流式细胞仪分析结果证实：1）同等条件下，叶酸受体阳性的喉癌Hep-2细胞对叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子的摄取能力要高于叶酸受体阴性的肺癌A549细胞。2）负载的顺铂浓度相同前提下，负载顺铂的叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的作用要高于单纯顺铂组。三、体内试验表明，负载顺铂的叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子对接种喉癌Hep-2细胞的裸鼠的荷瘤抑制作用强于对照组。Tunel检测法的结果也都证明了被叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子负载的顺铂较单纯顺铂处理的肿瘤组织有着更强的凋亡趋势表现。通过Western blot检测细胞凋亡因子，结果证实分别应用负载顺铂的叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子（cisplatin-loadedMSN@p(NIPAM-co-MA)-FA）、单纯顺铂和负载顺铂的pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子（cisplatin-loadedMSN@p(NIPAM-co-MA)）作用于Hep-2喉癌细胞后，前者的p53和Bax的表达高于后面两组，证实发生了有效的细胞凋亡。【结论】本研究首次将制备的功能化二氧化硅纳米粒子负载化疗药物应用于喉癌Hep-2细胞的凋亡研究，通过上述研究证实叶酸化-pH/温度智能双响应可控释介孔二氧化硅纳米粒子作为化疗药顺铂的药物载体，能够增强化疗药物诱导喉癌细胞凋亡的作用及对肿瘤的抑制作用。