植物病毒编码的运动蛋白(MP)在病毒的胞间转移过程中担负着重要作用。目前,草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)编码的MP蛋白尚不明确,SVBV侵染寄主植物后,病毒粒子如何实现胞间转移的机制也不清楚。因此,本研究利用亚细胞定位、质壁分离、细胞共定位以及运动缺陷型病毒载体互补试验等方法,确定了SVBV编码的P1蛋白是MP蛋白,再利用双分子荧光互补(Bi FC)、酵母双杂交和凝胶阻滞等试验方法,初步探究了SVBV MP蛋白的胞间运动模式。另外,本研究制备了SVBV MP蛋白的多抗血清,为更加深入地研究SVBV MP蛋白的功能奠定了基础。1 SVBV MP蛋白的鉴定克隆SVBV P1基因,插入p1300-YFP,得到重组表达质粒p1300-P1-YFP。插入p Bin438,得到重组表达质粒p Bin-P1。(1)P1的亚细胞定位含p1300-MPTMV-YFP,p1300-P1-YFP和空载体p1300-YFP的农杆菌分别浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片,浸润p1300-MPTMV-YFP和p1300-P1-YFP后,荧光在细胞壁上呈不连续的点刻状分布,而浸润空载体p1300-YFP,细胞壁上没有出现不连续的点刻状荧光。(2)P1与MPTMV的共定位p1300-P1-YFP与MPTMV-RFP共浸润本氏烟叶片。P1与MPTMV可以在胞间连丝(plasmodesmata,PD)共定位。(3)P1的胞间运动含p1300-MPTMV-YFP,p1300-P1-YFP和空载体p1300-YFP的农杆菌稀释至OD600=0.001,分别浸润本氏烟叶片,发现p1300-MPTMV-YFP,p1300-P1-YFP能在本氏烟细胞间自主运动并扩散到周围邻近细胞,而p1300-YFP仅定位于单个细胞,不能向邻近细胞扩散。(4)P1的运动回补功能将p Bin-P1、p Bin-P25及空载体p Bin438分别与PVX(△P25)-GFP共浸润本氏烟叶片。结果表明,p Bin-P1与p Bin-P25都能够互补PVX(△P25)-GFP在本氏烟细胞间的运动,而空载体p Bin438不能互补PVX(△P25)-GFP在本氏烟细胞间的运动。上述研究表明,SVBV编码的P1蛋白能定位于细胞外围,质壁分离实验进一步表明,P1能在细胞壁上形成不连续的点刻状;通过与MPTMV共定位实验,进一步确认了P1定位的位置是在PD处;P1不仅具有自主运动功能,而且能回补运动缺陷型病毒载体的运动功能。因此,鉴定SVBV编码的P1蛋白是MP蛋白。2 SVBV P1蛋白与P4蛋白(CP蛋白)互作的验证克隆SVBV P1和P4基因,分别插入p CV-c YFP和p CV-n YFP构建重组表达载体p CV-P1-c YFP、p CV-P1-n YFP、p CV-P4-c YFP和p CV-P4-n YFP。分别插入p GADT7和p GBKT7构建重组表达载体p GAD-P1、p GBK-P1、p GAD-P4和p GBK-P4。(1)Bi FC验证P1与P4的互作将p CV-P1-n YFP与p CV-P4-c YFP及p CV-P1-c YFP与p CV-P4-n YFP分别共浸润本氏烟。结果发现,有完整的细胞出现黄色荧光,确认了SVBV编码的P1蛋白能与P4蛋白互作。(2)酵母双杂交验证P1与P4的互作将p GAD-P1与p GBK-P4及p GAD-P4与p GBK-P1分别共转化酵母,结果发现,仅p GAD-P4与p GBK-P1共转化,平板上能够生长出白色酵母菌落,说明P1能够与P4互作。3 SVBV P1蛋白与ds DNA结合能力的验证体外转录250 bp ds DNA片段,并用[Dig]UTP标记,将标记后的ds DNA片段和纯化的P1蛋白混合孵育,经琼脂糖凝胶电泳分析,显色后发现,P1不能阻滞ds DNA的迁移,故P1不具有ds DNA结合能力。4 SVBV P1蛋白的原核表达及其多抗血清的制备将P1基因插入原核表达载体p ET-32a,获得重组表达载体p ET-32a-P1。p ET-32a-P1转化大肠杆菌,经IPTG诱导与Ni+-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为56 k D的融合蛋白。Western blot分析显示,His单抗能够与纯化的融合蛋白发生特异性反应,表明本研究成功得到了P1融合蛋白。利用纯化的P1蛋白免疫家兔,成功制备了P1抗血清,为深入研究P1基因的功能奠定了基础。