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核受体相关因子1的功能研究及其调控相关基因的筛选研究背景：多巴胺能神经元主要分布于中脑黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA），它在调节大脑多种复杂的生理功能中发挥着重要作用，包括随意运动以及奖赏、成瘾等动机行为，其功能异常与帕金森病（Parkinson disease，PD）和药物成瘾（drug dependence／drug addiction）等多巴胺系统疾病密切相关。从酪氨酸到多巴胺（Dopamine，DA）需要经过两个酶解过程，第一个限速酶为酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH），它能将酪氨酸代谢为多巴胺前体L-多巴，后者再经过芳香左旋氨基酸脱羧酶（AADC）代谢为DA。而L-多巴可以透过血脑屏障，并被内源性AADC代谢为DA，从而成为PD的主要治疗药物。核受体相关因子1（nuclear receptor-related factor 1，Nurr1／NR4A2／NOT／RNR-1／HZF-3）是一种转录因子，与NGFI-B、Nor1均属于核甾体／甲状腺激素受体超家族成员，它主要表达于中枢神经系统，特别是中脑黑质、腹侧被盖区以及边缘系统。最近有研究表明，Nurr1作为基因转录调控蛋白对DA能神经元的发育、迁移以及存活起关键作用。中脑黑质内Nurr1缺失或功能改变与PD相关，并与其他一些神经精神疾病如精神分裂症、躁狂、可卡因易感等有关。因此，Nurr1已被认为是PD和药物依赖等疾病的重要候选基因。然而，Nurr1在DA神经元发育分化中的调控机制还不清楚，它对DA能神经元表型标记物酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的调控作用以及促进DA能神经元的成熟方面仍存在争议。另外，我们的近期研究结果提示，GABA转运蛋白亚型1（GABA transporter-1，GAT1）在吗啡和酒精的依赖机制中可能发挥重要作用，但是其具体机制尚不清楚。已有研究表明Nurr1在酒精和可卡因的奖赏强化过程中起重要作用，因此，我们推测Nurr1可能在GAT1导致的药物成瘾机制中起也起到类似的调节作用。材料与方法：本实验共分三个部分，其中第一、第二部分为体外研究，分别按照如下步骤进行。（1）第一部分分三步进行：首先，利用RT-PCR方法对小鼠Nurr1基因进行克隆，然后将其亚克隆至pEGFP-C1质粒的多克隆位点中；其次，将经过酶切和测序证实正确的Nurr1表达质粒用LipofectamineTM 2000转染至MN9D细胞中；最后，提取细胞mRNA和总蛋白并利用半定量RT-PCR、实时定量PCR以及免疫印迹技术分别检测Nurr1和TH mRNA和蛋白的表达。同时，利用倒置荧光显微镜观察MN9D细胞的神经突起生长情况，并进行拍照。（2）第二部分亦分三步进行：首先，选择两段RNA干扰靶序列，合成两对编码发夹siRNA序列的单链寡核苷酸，并将其克隆到pSilenCircle载体中，构建含目的基因片段的重组质粒pSC-N1和pSC-N2以及无关基因作为阴性对照质粒，经过转化、扩增以及纯化后进行酶切和测序鉴定。其次，将经过酶切和测序证实正确的质粒用LipofectamineTM 2000转染至MN9D细胞中，并用G418筛选两周；最后，提取细胞mRNA和总蛋白并利用半定量RT-PCR、实时定量PCR以及免疫印迹技术分别检测Nurr1和TH mRNA和蛋白的表达。同时，利用倒置荧光显微镜观察MN9D细胞的神经突起生长情况，并进行拍照。（3）第三部分分两个过程：首先，为了进一步证实GAT1基因同源重组的正确性，利用免疫印迹和免疫组化技术对9只GAT基因敲除小鼠（野生型、杂合子和纯合子各三只）海马GAT1蛋白的表达进行了检测；其次，利用实时定量PCR和免疫组化技术检测9只GAT1基因敲除小鼠（野生型、杂合子和纯合子各三只）纹状体和中脑内Nurr1 mRNA和蛋白的表达变化情况。（4）第四部分主要是利用Affymetrix寡核苷酸芯片来寻找MN9D细胞内受到Nurr1诱导而发生变化的基因。首先，常规培养实验组（Nurr1过表达MN9D细胞）和对照组细胞（用RNA干扰产生的Nurr1下调MN9D细胞），提取各组细胞总RNA并逆转录为cDNA。然后合成生物素标记的cRNA，并片断化。最后杂交、洗脱、染色、芯片扫描并利用GCOS软件进行数据分析。结果：下列分别是三部分实验的结果：（1）酶切和测序鉴定证实Nurr1真核表达载体构建成功，Nurr1过表达MN9D细胞内Nurr1 mRNA和蛋白表达明显升高，同时TH mRNA和蛋白表达也明显增高，而RTH升高程度更为显著。另外，Nurr1过表达MN9D细胞的平均神经突起数目、平均神经突起长度和神经突起总长度均明显增加，提示Nurr1可能诱导DA细胞以神经突起延长的特征的细胞成熟和形态分化。（2）酶切和测序鉴定证实Nurr1和无关基因的shRNA表达载体构建成功；pSC-N1和pSC-N2可特异性抑制MN9D细胞中Nurr1 mRNA的表达，下降率分别为62.3％和45.6％；并能使其下游基因THmRNA的表达明显下调，下降率分别为76.3％和62.6％。同时Nurr1和TH蛋白表达亦明显下调，而且TH蛋白表达的下调更为明显。Nurr1和TH蛋白的下降率分别为57.4％、72.0％以及79.1％、70.1％。而阴性对照质粒和脂质体组对两者的mRNA和蛋白没有抑制作用。Nurr1表达下调后MN9D细胞的神经突起数目和长度有所减少，但是无统计学差异。（3）GAT1基因敲除杂合子和纯合子小鼠海马内GAT1蛋白的表达缺失，而野生型小鼠海马内GAT1蛋白表达正常存在，提示GAT1基因同源重组正确。利用实时定量PCR检测发现，与野生型小鼠相比，杂合子和纯合子小鼠脑纹状体内Nurr1 mRNA表达明显增高（p＜0.05）；与野生型和杂合子小鼠相比，纯合子小鼠中脑内Nurr1 mRNA显著升高（p＜0.01）。免疫组化检测结果提示，与野生型小鼠相比，杂合子、纯合子小鼠纹状体区域Nurr1免疫阳性细胞数显著增多（p＜0.01）。杂合子和纯合子小鼠中脑黑质区域Nurr1免疫阳性细胞数比野生型小鼠稍多，但是无统计学差异（p＞0.05）。另外，纯合子小鼠中脑黑质以及杂合子小鼠纹状体区域Nurr1免疫阳性细胞染色明显比野生型和杂合子要深。（4）基因芯片筛选结果发现，有80条基因表达上调、8条基因表达下调，它们主要编码信号转导蛋白、发育和分化相关蛋白、生物合成以及代谢相关蛋白、参与炎症反应和免疫应答蛋白、凋亡、内质网应激以及细胞周期蛋白等。另外，还有24调节基因编码未知功能蛋白。结论：（1）MN9D细胞内过表达Nurr1能促进TH mRNA和蛋白的表达，并能增加细胞神经突起的延长，提示Nurr1对多巴胺能神经元的发育具有关键作用，同时表明它在维持多巴胺能神经元的成熟中具有重要功能。由于DA能神经元能调节随意运动，其变性会导致PD的发生，因此Nurr1对DA能神经元的这种重要功能提示其在PD的基因治疗中具有潜在价值。（2）经过酶切和测序鉴定正确的pSC-N1、pSC-N2质粒能特异性地抑制Nurr1 mRNA和蛋白的表达，提示本实验成功地构建了Nurr1 shRNA的表达载体。同时，它能使TH的表达显著下调，提示Nurr1对多巴胺能神经元内TH的表达调控起关键作用。因此，Nurr1 shRNA特异性表达载体可能为进一步在体内研究PD以及多巴胺能神经元发育相关基因的功能提供新的有效的研究方法。（3）GAT1基因敲除杂合子和纯合子小鼠脑部纹状体内Nurr1 mRNA以及蛋白的表达增强可能是对GAT1表达缺失后导致的GABA失衡产生的一种保护性效应。Nurr1能加强酒精和可卡因依赖的强化特性中的奖赏机制，因此它可能在GAT1相关的药物成瘾机制中发挥正向调节作用。此外，Nurr1可能是药物成瘾机制中DA系统和GABA系统之间的联络中介。（4）基因芯片结果提示，Nurr1可能参与了上述信号转导、分化与发育、生物合成与代谢等过程。尽管仍需要进一步实验加以证实，但是这些结果为我们提供了深入了解多巴胺细胞内Nurr1及其调控基因功能的线索。