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随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发,膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要经济价值和实际意义的当务之急。D-塔格糖是近年来发现的一种低热量的功能性单糖,属于稀有糖的一种,具有预防肥胖、抗龋齿、降血糖、改善肠道菌群及良好的理化性质等优点。作为一种新型的功能性甜味剂,D-塔格糖在食品、保健、医疗领域中均具有重要的应用价值。生物法制备D-塔格糖是近年来稀有糖研究领域的一个研究热点。L-阿拉伯糖异构酶可以催化醛酮糖的异构化反应,实现从D-半乳糖经一步转化为D-塔格糖。L-阿拉伯糖异构酶可以分别催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖异构化为L-核酮糖和D-塔格糖,被认为是目前生物法生产D-塔格糖最有效的酶。
本研究前期通过对解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC43068全细胞催化反应及产物进行分析,确定该菌株具有催化D-半乳糖异构化反应的能力,该反应产物经鉴定为D-塔格糖,并无副产物检出。在此基础上本论文对该解纤维热酸菌(Acidothermus cellulotics)ATCC43068全基因组中预测的L-阿拉伯糖异构酶基因进行了克隆与表达、酶的分离纯化、活性鉴定、酶学性质、结构与功能关系的分子改造等方面的研究,具体包括以下几部分内容:
1.通过PCR扩增获得来源于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC43068的L-5可拉伯糖异构酶的基因序列。通过结构基因比较,对该酶基因进行序列分析:该araA基因全长1506 bp,编码501个氨基酸残基,其翻译得到的多肽相对分子质量经计算为54,768 Da。该基因已提交到GenBank数据库,数据库登记号为:GU188440。通过同源性比较分析发现该酶与不同微生物来源的L-5可拉伯糖异构酶具有较高的保守性,同源性在42-62％之间。
2.将该araA基因插入表达载体pET-22b(+)中并转化至相应的表达宿主E.coliBL21(DE3)中,分别成功构建带有目的基因araA的重组菌株E.coli BL21/pET-araA和目的基因C端融合了His-Tag的E coli BL21/pET-araA-his。
3.考察了重组基因工程菌的诱导表达条件,发现以L-阿拉伯糖代替IPTG为诱导物,37℃恒温诱导培养,目的基因的诱导表达效果最好,诱导8 h时表达已达到最高。并通过全细胞转化对重组基因工程菌所产L-阿拉伯糖异构酶的活性进行了研究,反应产物经高效液相和核磁共振鉴定为D-塔格糖,并无副产物检出。
4.对未融合His-Tag的重组L-阿拉伯糖异构酶依次通过热处理、离子交换色谱、凝胶过滤色谱进行了分离并达到电泳纯,并结合SDS-PAGE和凝胶过滤色谱对酶的纯度和分子量进行鉴定,分析结果表明,该L-阿拉伯糖异构酶为四聚体酶,单体分子量约为55;对融合了His-Tag的重组L-阿拉伯糖异构酶则采用Ni柱亲和层析法一步进行分离纯化至电泳纯。纯化后融合了His-Tag的重组L-阿拉伯糖异构酶的比酶活仅为4.16U/mg,而未含有His-Tag的重组L-阿拉伯糖异构酶比酶活为20.88 U/mg,并通过两种重组酶的活性比较推测该酶为金属性蛋白酶。
5.对重组L-阿拉伯糖异构酶的酶学特性进行了全面的研究,发现该酶在75℃和pH7.5条件下表现出催化D-半乳糖的最高活性;并且其具有良好的热稳定性和较宽的pH范围,65℃以下保持相对稳定,在pH6.0-8.0之间都表现出90％以上活性;Mn2+和/或Co2+对该酶的活性和热稳定性都有明显的促进作用,而Cu2+和Hg2+则对酶产生了明显的抑制作用;该酶对L-阿拉伯糖表现出最高的底物特异性,其次为D-半乳糖;其催化L-5可拉伯糖的动力学参数Km、Vmax及催化效率kcat/Km分别为15.2 mM、6.8 U/mg和24.6 min-1 mM-1,催化D-半乳糖的Km、Vmax和kcat/Km分别为28.9 mM,4.9 U/mg和9.3 min-1mM-1。
6.在大肠杆菌L-阿拉伯糖异构酶晶体结构的基础上,模拟得到了解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC43068的L-阿拉伯糖异构酶单体及活性中心与底物作用的结构模型。在结构模拟的基础上,通过结构分析和理性设计,预测出该L-阿拉伯糖异构酶的活性中心区域由L20、Y21、Y336、N123、N125、H129和Mn2+组成,并成功构建突变体L20A、Y21A、Y336A、N123A、N125A和H129A,其中突变体酶L20A对D-半乳糖的底物亲和性显著提高,为野生型酶酶活的2.2倍,催化效率由9.3 min-1mM-1提高到13.6 min-1 mM-1,而在Y21、Y336、N123和N125位上的突变均导致催化活性的明显降低,说明了这些位点在催化过程中重要作用,并对其功能进行了预测。