目的:宫颈癌是全球女性第四大肿瘤,对广大妇女身心健康和生命安全构成了严重威胁。HPV16持续感染为宫颈癌变的主要病因,HPV16基因与宿主染色体整合是宫颈癌变发生的关键环节,与致瘤密切相关的基因为E2和E6。E6是病毒致癌基因,参与细胞的永生化和恶性转化;E2是病毒整合关键基因,E2蛋白可抑制E6基因表达。核内不均一性核糖核蛋白 K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNP K)是一种核酸结合蛋白,具有与HPV16基因发生特异性结合的独特分子结构,可参与调控基因转录、mRNA可变剪切、mRNA多聚腺苷酸化、mRNA稳定、mRNA翻译,以及信号转导等一系列生物学功能,与肿瘤的发生和发展密切相关。然而,hnRNPK在宫颈癌变过程中的作用及对HPV16 E2、E6基因的调控作用不明。本研究从人群研究、体外细胞实验两个层面展开,结合生物信息学分析,综合评价hnRNP K对HPV16 E2、E6基因的调控及其在宫颈癌变过程中的作用和可能的分子机制,为进一步研究宫颈病变的生物学机制奠定理论基础,为宫颈癌的诊断和治疗开拓新思路。方法:1.人群研究:从前期建立的社区队列(山西省介休市)和医院队列(山西省肿瘤医院和山西医科大学第二医院)中选取2014年6月至2015年06月正常宫颈(NC)妇女67例、低度宫颈上皮内瘤变(CIN Ⅰ)患者69例、高度子宫颈上皮内瘤变(CINⅡ/Ⅲ)患者68例、宫颈鳞状细胞癌(SCC)患者53例为研究对象,形成宫颈病变进展的自然人群阶梯。严格按照纳入和排除标准入组。采用经前期验证的结构式调查问卷,收集人口学资料、婚育史、既往病史及家族病史、个人卫生习惯史等信息;采集宫颈脱落细胞和宫颈活检或手术组织,应用分子导流杂交法检测HPVs感染状况,采用免疫组化(IHC)和Western blot技术检测宫颈组织中hnRNPK蛋白表达水平,应用Western blot法检测宫颈组织中HPV16 E2、E6蛋白表达水平。2.体外实验研究:选取病理类型为人宫颈鳞癌细胞且HPV16感染阳性的SiHa细胞株为体外实验细胞株。通过shRNA干扰和过表达质粒转染技术建立hnRNP K基因沉默和过表达细胞株,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡和周期,real-time PCR和Western-blot技术分别检测hnRNP1K、HPV16E2、HPV16E6、c-Myc、β-actin基因mRNA和蛋白表达水平。染色质免疫沉淀测序技术检测hnRNPK与人类全基因组的结合位点,Real-time PCR进一步检测hnRNPK与HPV16基因调控元件、c-Myc启动子区结合位点。3.生物信息学分析:利用高通量基因表达公共数据库GEO(Gene Expression Omnibus),选取包含宫颈癌或者宫颈上皮内瘤变样本的基因芯片数据集作为研究对象。纳入的数据集分别为GSE6791、GSE7803和GSE63514。单因素分析不同宫颈病变组hnRNPKmRNA表达情况,佐证人群和体外实验研究结果。此外,对肿瘤基因组图谱数据库TCGA(The Cancer Genome Atlas)中308例宫颈癌样本,采用GSEA(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)工具进行生物学通路富集分析,了解hnRNP K基因在宫颈癌变中可能参与哪些生物学过程,以及分析hnRNPK与c-Myc表达的相关性。4.资料分析:利用Epidata3.1程序包进行数据双份录入、核查,采用SPSS 23.0和Graphpad prism 6.0程序包分别进行统计分析和作图。采用X2检验、趋势X2检验、单因素方差分析进行假设检验,多重比较使用Bonferroni法。多因素分析和OR值计算采用非条件logistic回归法,两定量资料的相关性分析采用Spearman秩相关法。两因素间交互作用的分析采用相加模型及其交互作用指标RERI、AP和S。结果:1.HPV感染与宫颈病变的关系:在NC、CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ和SCC组中,HPVs的感染率分别为 19.4%、40.6%、60.3%和84.9%,HPV16的感染率分别为 10.4%、14.5%、41.2%和66.0%;多组间比较有统计学意义(P<0.001)。且随着宫颈病变的加重,HPVs和HPV16的感染率都逐渐升高(X2趋势=55.88,P<0.001;X2趋势=51.13,P<0.001)。2.HPV16E2、E6与宫颈病变的关系:HPV16E2和E6蛋白表达在不同宫颈病变组间差别均有统计学意义(H=26.35,P<0.001;H=21.10,P<0.001)。HPV16E2蛋白表达量在SCC组、CINⅡ/Ⅲ组均低于CINⅠ、NC组,HPV16E6蛋白表达量在SCC组、CINⅡ/Ⅲ组均高于CINⅠ、NC组(P<0.0083)。而HPV16E2和E6蛋白表达在SCC组与CINⅡ/Ⅲ组,以及CINⅠ组与NC组间无统计学差异。随着宫颈病变的加重,HPV16E2的低表达率和HPV16 E6的高表达率都逐渐升高(X2趋势=15.51,P<0.001;X2趋势=12.33,P<0.001)。在NC、CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ和SCC组中E2/E6蛋白表达的比值中位数分别为8.09、9.41、1.98和1.27,多组间比较有差异(P<0.001),多重比较发现,E2/E6比值在SCC组、CINⅡ/Ⅲ组均低于NC组,SCC组低于CINI组(P<0.0083);但在SCC组与CINⅡ/Ⅲ组,以及CINⅠ组与NC组间的差异均无统计学意义。3.hnRNPK与宫颈病变的关系:免疫组化法结果显示,hnRNPK蛋白在正常宫颈上皮主要表达于细胞核,部分存在于细胞质中,呈棕黄色;随着宫颈病变进展,细胞核和细胞质中其蛋白表达均有增加。Western blot结果显示,hnRNPK表达量总体分布有差别(H=58.43,P<0.001),多重比较发现hnRNPK表达量在SCC组与CINⅡ/Ⅲ组无差异,其余任意两组之间均有差异(P<0.0083),CIN I组高于NC组,SCC组和CINⅡ/Ⅲ组高于CIN I组和NC组。随着宫颈病变加重,hnRNPK表达量呈逐渐升高趋势(X2趋势=29.84,P=0.001)。4.不同宫颈病变组hnRNPK与HPV16感染的交互效应分析:以NC组为对照组,显示hnRNP K蛋白高表达与HPV16感染在CINⅡ/Ⅲ和SCC均存在正相加交互作用,交互作用指标S显示正相加效应;而在CINI组尚未发现有正相加交互作用。5.hnRNPK、HPV16E2、E6在宫颈病变中的相关性分析:Spearman秩相关分析显示,hnRNPK与HPV16E6之间存在正相关关系(rs=0.254,P=0.023),hnRNPK与HPV16 E2(rs=-0.280,P=0.012)、hnRNPK与E2/E6(rs=-0.243,P=0.030)、HPV16E2与E6(rs=-0.377,P=0.001)之间存在负相关关系。6.hnRNPK对SiHa细胞生物学功能的影响:下调SiHa细胞hnRNPK表达后,SiHa细胞活性降低,G0/G1期细胞比例增加,S期、G2/M期细胞比例及细胞增殖指数下降,细胞晚期凋亡率和总凋亡率升高(P<0.05)。上调SiHa细胞hnRNPK表达后,SiHa细胞活性升高,G0/G1期细胞比例降低,S期和细胞增殖指数增加,细胞晚期凋亡率和总凋亡率降低(P<0.05)。7.hnRNP K对HPV16 E2和E6基因表达的影响:下调SiHa细胞hnRNP K表达后,HPV16 E2和E6基因的mRNA表达水平均降低,HPV16 E6基因的蛋白表达水平也降低(P<0.05)。上调SiHa细胞hnRNPK表达后,HPV16E2和E6基因的mRNA表达水平均升高,HPV16E6基因的蛋白表达水平也升高(P<0.05)。HPV16E2蛋白在所有干预组中均未被检测到。8.hnRNPK与HPV16基因和人类基因调控区域结合位点分析:ChIPreal-time PCR结果显示,hnRNPK可与HPV16基因调控区域的7555F/7681R和7854F/65R基因片段特异性结合(P<0.05)。ChIP-Seq结果表明,hnRNPK结合的人类靶基因为1321个,位于c-Myc基因启动子区的hnRNP K蛋白DNA结合位点富集倍数较高。Real-time PCR进一步验证了hnRNPK可与c-Myc基因启动子区特异性结合(P<0.05)。9.hnRNPK对癌基因c-Myc表达的影响:下调SiHa细胞hnRNPK表达后,癌基因c-Myc的mRNA和蛋白表达水平均降低(P<0.05)。上调SiHa细胞hnRNPK表达后,癌基因c-Myc的mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05)。10.hnRNPK在不同宫颈病变中mRNA表达的生物信息学分析:GSE6791基因芯片数据集中,宫颈癌组的hnRNPK mRNA表达水平高于正常宫颈组(P<0.05)。GSE7803数据集中,SCC组和HSIL组的hnRNP K mRNA表达水平都高于NC组(P<0.0167)。GSE63514数据集中,hnRNPK mRNA在SCC组、CIN3组均高于NC组和CIN1/2组(P<0.0083)。11.hnRNPK在宫颈癌中参与的生物学功能预测:对TCGA宫颈癌数据库进行生物学通路富集分析,在hnRNPK mRNA高表达组中,上调表达的基因集有194个,其中显著上调富集基因集有7个(P<0.05),依次为细胞周期、RNA降解、基本转录因子、泛素介导的蛋白质降解、ATM信号通路和核苷酸切除修复通路。12.hnRNPK和c-Myc在宫颈癌中的相关性分析:TCGA宫颈癌数据库中,hnRNP K mRNA高表达组的c-Myc mRNA表达水平高于hnRNPK mRNA低表达组(P<0.05)。对hnRNP K和Myc mRNA定量资料进行Spearman秩相关,结果显示两者呈正相关(rs=0.190,P=0.001)。结论:1.HPVs感染尤其是HPV16感染是宫颈癌变发生的危险因素,因此早期开展HPV筛查,接种HPV疫苗,积极控制HPV感染,有助于降低宫颈癌的发生风险。HPV16E6蛋白高表达和HPV16 E2蛋白低表达增加宫颈癌变的发生风险。提示E2/E6蛋白比值可能作为高度宫颈上皮内瘤变及宫颈癌发生潜在的生物学标志物。2.hnRNPK高表达增加宫颈癌变的发生风险,提示可能作为宫颈病变潜在的生物学标志物。hnRNPK可增加宫颈癌细胞增殖能力、增强细胞周期向G2/M期转变,抑制细胞凋亡,可成为宫颈癌潜在的生物干预靶点。3.hnRNPK高表达与HPV16感染对CINⅡ/Ⅲ和宫颈癌的发生可能具有正相加交互效应。hnRNPK可能通过与HPV16基因转录调控元件特异结合,促进E2、E6基因转录,上调E2、E6mRNA水平,增加癌基因E6蛋白表达量,促进宫颈癌变。4.hnRNPK可通过与细胞癌基因c-Myc启动子区结合增强转录,上调c-Myc表达,促进宫颈癌变。5.hnRNPK在宫颈癌中与RNA降解、基本转录因子、泛素介导的蛋白质降解、ATM信号通路和核苷酸切除修复通路密切相关,但需进一步深入研究。