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第一部分GPC4在小鼠脂肪中的表达及GPC4过表达质粒和shRNA的构建目的:检测GPC4在小鼠脂肪中的表达情况,构建基于小鼠GPC4基因的过表达质粒及sh-RNA抑制质粒,为进一步研究GPC4在脂肪转化中的作用提供基础。方法:采用Western blot检测C57BL/6J小鼠的iWAT,eWAT及BAT中GPC4的蛋白表达量。设计小鼠GPC4的引物,利用载体pcDNA3.1(+)构建GPC4过表达质粒;设计小鼠GPC4抑制质粒引物,构建GPC4的抑制质粒。成功的诱导分化3T3-L1前脂肪细胞后,转染GPC4过表达质粒及抑制质粒后,用RT-QPCR及Western blot检测GPC4mRNA及蛋白的表达量。结果:GPC4在iWAT显著高于eWAT及BAT(P<0.001);GPC4过表达质粒测序结果显示与GPC4相符;GPC4在3T3-L1细胞过表达后,GPC4的mRNA及蛋白的表达量显著增高(P<0.001);GPC4在3T3-L1细胞抑制后,GPC4的mRNA及蛋白的表达量显著降低(P<0.001)。结论:GPC4可能与白色脂肪的褐变相关,GPC4过表达质粒及抑制质粒构建成功。第二部分脂肪细胞中GPC4促进白色脂肪褐变目的:探讨GPC4在3T3-L1前脂肪细胞褐变过程中的作用。方法:将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成功后,分别转染GPC4过表达及抑制质粒,再进行寒冷暴露或者罗格列酮刺激褐变。用RT-QPCR检测基因UCP1、PGC1α、PPARγ、TMEM26、P2RX5、DIO2、CIDEA、ELOVL3、PRDM16、Hoxc8、FASN、TCF21等m RNA表达量的变化;用油红染色观察脂肪细胞的脂滴情况;用Western blot检测GPC4、UCP1、p-mTOR、t-mTOR、rictor、raptor、p-AMPK、t-AMPK、p-ERK、t-ERK以及内参GAPDH的蛋白表达量。结果:在没有寒冷暴露及罗格列酮刺激下,GPC4过表达的脂肪细胞中,PPARγ基因m RNA表达量显著增高(P<0.05),其他基因没有显著性变化;在寒冷暴露和罗格列酮刺激下,GPC4的过表达增强了3T3-L1的褐变,与对照组相比棕色脂肪相关基因m RNA表达量显著增加(P<0.05),而GPC4抑制后棕色脂肪相关基因m RNA表达量显著降低(P<0.05);油红染色显示,GPC4过表达组脂肪细胞多房脂滴增加,GPC4抑制组中多房脂滴减少;GPC4过表达组中UCP1的蛋白表达量显著增加(P<0.01),同时,p-mTOR/t-mTOR及raptor的蛋白表达量也显著增加,GPC4抑制组中UCP1、p-mTOR/t-mTOR、raptor蛋白表达量均显著降低(P<0.01),而蛋白p-AMPK/t-AMPK、p-ERK/t-ERK、rictor的表达没有明显差异。结论:GPC4在寒冷暴露及罗格列酮刺激下参与褐变并促进褐变及蛋白UCP1的生成,且GPC4可能通过与mTOR/raptor相互作用参与褐变。第三部分GPC4通过与RAPTOR相互作用促进褐变目的:研究raptor是否参与GPC4在褐变中的作用及其作用机制。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导分化成功后,共转染GPC4过表达质粒及raptor过表达质粒,用IP裂解液收集细胞蛋白,一部分用于后续Western blot检测,剩下的部分分别用磁珠包被Ig G及GPC4抗体进行免疫沉淀,再进行免疫印迹检测Ig G组,GPC4组的raptor的蛋白表达情况,同时检测Input组蛋白raptor、GPC4、GAPDH的表达量。结果:Co-IP结果显示,与Ig G组对照,GPC4组在分子量150处有raptor蛋白存在,但Ig G组没有;Input中,GPC4组和Ig G组蛋白GPC4、raptor、GAPDH均有表达,且蛋白表达量没有显著差异。Raptor能被GPC4抗体沉淀下来,即蛋白raptor和GPC4直接或者间接的相互作用。结论:GPC4通过与raptor直接或者间接的相互作用促进3T3-L1细胞褐变。