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极低频电磁场(Extremely low frequency electromagnetic field,简称ELF-EMF)是指频率在300Hz以下的交变电磁场,主要由高压输电线、电力供应和各种家用电器等产生。近年来大量研究表明,ELF-EMF与神经、心血管、免疫和生殖系统的病变有关。神经组织具备高度的电兴奋性,因此对ELF-EMF非常敏感。目前,研究ELF-EMF仍集中在风险评估阶段,缺乏防护措施的报道。本课题组前期以莲房原花青素(Lotus seedpod procyanidins,简称LSPCs)为实验材料,以原代海马神经元为细胞模型,初步探讨了LSPCs对ELF-EMF致海马神经元氧化损伤的预防作用,基于此,本论文继续深入研究ELF-EMF对海马神经元氧化应激损伤的可能机制、细胞凋亡的介导途径、突触可塑性变化的相关影响及LSPCs的预防作用,旨在为ELF-EMF的膳食保护提供更多理论依据。主要研究内容如下: 1.LSPCs对ELF-EMF致海马神经元氧化应激的预防作用 实验分为正常组、ELF-EMF组和LSPCs预防组(2.5、5、10μg/mL),其中LSPCs预防组在辐照前4h加药,辐照条件为:海马神经元培养的第7d在50Hz、8mT的ELF-EMF下辐照90min。结果显示,3个LSPCs预防组中海马神经元形态较ELF-EMF有明显改善,其中10μg/mL LSPCs组细胞形态接近正常组。ELF-EMF组GSH含量、GSH-Px及T-AOC活性与正常组相比显著降低(P<0.01),给予LSPCs预处理后能有效改善上述症状。免疫印迹结果显示,3个LSPCs预防组SOD-1、SOD-2和CAT蛋白表达量明显上调(P<0.05,与ELF-EMF组相比)。以上表明,LSPCs对ELF-EMF致海马神经元氧化应激损伤有明显的预防作用,可能与其有效清除ROS和增强抗氧化酶活性有关。 2.LSPCs对ELF-EMF致海马神经元细胞凋亡的预防机制 实验分组及药物剂量同上,ELF-EMF辐照结束后,利用MTT法测定海马神经元的细胞存活率;利用流式细胞术测定细胞周期;采用AnnexinⅤ-FITC双染及TUNEL法测定不同组的海马神经元细胞凋亡程度;利用单细胞凝胶电泳检测ELF-EMF致海马神经元DNA的损伤;选用JC-1荧光探针测定细胞内线粒体膜电位的变化;最后利用Western blot检测ELF-EMF致神经元细胞凋亡的关键蛋白表达,揭示ELF-EMF致海马神经元细胞凋亡的依赖途径。结果表明,ELF-EMF辐照导致神经元细胞存活率降低,细胞周期阻滞在S期,凋亡细胞比率显著上升,DNA损伤严重(P<0.01,以上均与正常组相比)。此外,ELF-EMF辐照致使海马神经元线粒体膜电位下降,线粒体释放Cytochrome C至胞浆,抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2表达下调,促凋亡蛋白Bax表达上调,最终激活了caspase-3蛋白(P<0.01,以上均与正常组相比),导致细胞凋亡。由此说明,ELF-EMF导致海马神经元细胞凋亡与线粒体依赖途径相关。 经LSPCs预处理后,由ELF-EMF诱导细胞凋亡有关途径的关键因素得到有效改善,其中10μg/mL LSPCs组效果最佳,趋于正常组。表明LSPCs能够有效改善冈ELF-EMF辐照造成的神经元细胞凋亡,在一定程度上提高了细胞存活率、缓解了细胞凋亡及DNA损伤,进而通过线粒体凋亡途径调控关键蛋白的表达。 3.LSPCs对ELF-EMF致海马神经元突触可塑性变化的影响 实验分组及药物剂量同上。结果表明,ELF-EMF辐照引起多突起神经元数目减少、突起长度减短,免疫荧光显色及免疫印迹检测表明ELF-EMF诱发与突触可塑性相关的SYN、Arc和MAP-2蛋白表达下调(P<0.01,均与正常组相比)。然而实验剂量的LSPCs预处理能有效缓解上述现象,其中10μg/mL LSPCs组效果最佳。以上表明LSPCs能够有效改善凶ELF-EMF辐照导致的神经元突触可塑性变化,对突触可塑性具有正调节作用。