【摘 要】
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诺如病毒（Norovirus,NoV）是引起非细菌性胃肠炎的重要病原。由于一直缺乏完善的细胞培养系统与小动物感染模型,极大地限制了疫苗和抗病毒药物的研究。NoV有丰富的遗传多样性,但不同型别毒株间难以形成免疫交叉保护效果。因此,解析不同基因型间免疫交叉的分子机制将为病毒疫苗设计提供重要理论支持。在过去几十年里,GⅡ.4型一直是造成暴发的主要流行基因型,然而在2014/2015年冬天,GⅡ.17 K
【基金项目】
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国家自然科学基金（31872912,31701717）; 国家重点研发计划项目（2018YFC1602500）; 广东省自然科学杰出青年基金项目（2019B151502065）; 广东省重点研发计划项目（2019B020209001）
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诺如病毒（Norovirus,NoV）是引起非细菌性胃肠炎的重要病原。由于一直缺乏完善的细胞培养系统与小动物感染模型,极大地限制了疫苗和抗病毒药物的研究。NoV有丰富的遗传多样性,但不同型别毒株间难以形成免疫交叉保护效果。因此,解析不同基因型间免疫交叉的分子机制将为病毒疫苗设计提供重要理论支持。在过去几十年里,GⅡ.4型一直是造成暴发的主要流行基因型,然而在2014/2015年冬天,GⅡ.17 Kawasaki变异株的出现一度超过GⅡ.4引发了新的流行高峰。因此,探究NoV新现变异株流行性的分子机制将为病毒防控提供新思路。本论文以NoV常见基因型代表株为研究对象,通过表征各基因型毒株VP1蛋白的免疫原性特点,分析表征了病毒免疫原性与遗传多样性的关联。此外,还针对衣壳蛋白变异影响GⅡ.17型新现变异株流行性的分子机制展开研究,具体工作做如下:1.人源NoV衣壳蛋白抗原库的构建。收集整理NoV基因组数据库信息,选择9株GI型（GI.1-GI.9）和19株GⅡ型（GⅡ.1-GⅡ.22,不包括猪源的GⅡ.11、GⅡ.18和GⅡ.19）代表毒株。通过大肠杆菌原核表达系统制备了28个不同基因型的病毒衣壳P蛋白。2.人源NoV衣壳P蛋白的免疫多样性。将制备的P蛋白免疫小鼠制备抗血清,ELISA结果显示每个抗血清效价均达10~5以上。在此基础上评价不同基因型病毒抗血清的结合广谱性。结果显示73.9%的抗血清广谱性较弱;GⅡ.5型抗血清可与7种病毒衣壳蛋白产生免疫交叉反应。初步显示GⅡ.5具有作为多价疫苗的潜力。此外,病毒P蛋白序列比对及进化分析显示仅16.5%的位点是保守的,保守位点423-431 aa、462-474 aa和517-531 aa可能是基因型间产生免疫交叉反应的原因。3.基于交叉免疫反应的GⅡ.17型NoV进化机制研究。选择GⅡ.17型NoV四个基因簇（A-D）的代表毒株制备衣壳P蛋白,免疫小鼠获得抗血清。唾液受体结合实验显示新现变异株（GⅡ.17 C和GⅡ.17 D）与A/B/O型HBGA及PGM的结合能力强于早先毒株（GⅡ.17 A和GⅡ.17 B）,表明GⅡ.17在进化过程中受体结合位点出现改变。不同基因簇间的血清抗体交叉反应显示早期毒株抗血清与新现变异株免疫应答较高,OD 450值在0.8-1.16之间;新现变异株株抗血清与早期毒株免疫应答较低,OD 450值在0.26-0.56之间。受体阻断实验显示早期毒株抗血清无法阻止新现变异株与受体结合。最后,突变分析显示353-363 aa、373-384 aa、394-404 aa和444-454 aa片段是影响GⅡ.17型内免疫交叉反应的重要位点。以上数据表明,最新的大流行变异株GⅡ.17 C和GⅡ.17 D通过受体结合能力的改变和抗原变异逃避了早先GⅡ.17 A和GⅡ.17 B毒株的群体免疫。本论文以NoV常见基因型代表株衣壳蛋白VP1为研究对象,系统性表征其免疫多样性,阐明基因型间免疫交叉反应的分子机制,为疫苗研制提供理论基础。同时以GⅡ.17型病毒衣壳蛋白的进化过程为切入点,理性设计衣壳蛋白突变体以解析关键氨基酸突变对免疫原性的影响,系统阐释了不同基因簇变异株受体结合功能的差异及免疫原性的变化,为病毒防控策略提供了新思路。
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