多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种呈世界性分布的中枢神经系统（central nervous system,CNS）的慢性自身免疫性疾病,由淋巴细胞、活化的小胶质细胞和巨噬细胞介导的神经炎症导致脱髓鞘、神经退行性病变,经常导致永久性的残疾。MS的发病机制及病因未完全明确,可能是遗传、神经元变性、炎症、免疫、环境地理等多因素共同作用的结果。目前公认的发病机制为异常的免疫攻击、多种免疫细胞及细胞因子的共同作用,引起炎症反应、髓鞘缺失、轴索损伤和细胞死亡。现阶段的抗炎、免疫调节或免疫抑制治疗,以及新获得的药物,在疾病的早期阶段部分有效,但对于进展型MS患者的益处非常有限,所以对于寻找MS新的药物研究迫在眉睫。作为经典的能量分子,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）不仅在能量代谢和线粒体功能中发挥重要作用,而且在衰老、基因表达、钙稳态和细胞死亡中也至关重要。NAD+是许多代谢途径中重要的辅因子,在MS的发病机制中,NAD+损害引起的功能障碍在神经变性中也发挥作用。自噬通过吞噬功能障碍的细胞器及错误折叠的蛋白质,在控制炎症和免疫方面均具有重要意义。自噬相关基因的改变或自噬途径的缺陷在神经退行性疾病中发挥重要作用,可通过促进间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞,提供针对神经系统疾病的保护。目前,NAD+在MS中是否有自噬参与的相关作用机制仍未明确。神经炎症已被证明是神经免疫性脱髓鞘病发病机制中的一个重要因素。有学者提出假设,即炎症反应的高耗能导致了线粒体功能受损,从而引起了神经元的能量代谢紊乱,导致不能完全维持神经元和轴突的功能,从而导致神经元死亡和/或轴突变性。炎症反应可能诱导神经元中能量相关的线粒体DNA损伤,使MS发生神经退行性变。炎症反应过程中涉及一种称为炎性小体的多分子复合物,导致炎性细胞因子的裂解和分泌。近年来,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor pyrin domain containing protein 3,NLRP3）炎性小体在MS及实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中越来越受到重视。MS患者的严重程度与白介素（interleukin）18（IL-18）和半胱天冬酶1（caspase1）水平密切相关,且携带NLRP3功能增益突变的患者表现出与MS的高度共病性。在EAE动物模型中,NLRP3基因缺陷小鼠的病程延迟、疾病严重程度降低,脱髓鞘程度和少突胶质细胞丢失减轻,星形胶质增生及炎性细胞浸润减少,外周淋巴组织中的Th1和Th17细胞减少。以上为研究为NLRP3炎性小体在EAE发病机制中的作用提供了的重要依据。本实验中,我们在完成EAE动物模型的基础上给予NAD+药物治疗后观察不同组别炎症细胞浸润和髓鞘损害的病理学分析,Th1及Th17细胞分化的影响及相关炎症细胞因子的变化,NAD+干预治疗后自噬相关蛋白及NLRP3炎性小体活性的变化及二者内在的联系,着重探讨NAD+药物干预是否可以通过影响自噬活性发挥抗炎作用,进而调节EAE的病情进展,初步揭示NAD+作用下自噬与NLRP3炎性小体的关联;并且分析了NLRP3炎性小体在MOG抗体相关疾病（MOG-Ab-associated disease,MOGAD）患者血清中急性期及缓解期的动态变化,为CNS炎性脱髓鞘病变潜在的发病机制及治疗方案寻找新方向。第一部分NAD+在EAE小鼠中的神经保护及抗炎作用目的:使用NAD+药物干预EAE小鼠,评估不同组别小鼠的发病情况及神经功能缺损评分,通过脊髓腰膨大组织HE染色、LFB染色病理学评价及qPCR方法,观察NAD+干预后EAE小鼠炎症细胞浸润、髓鞘损害以及炎症因子的变化情况。方法:1.实验动物及分组。选取体重约18±2g,年龄在6-8周的SPF级雌性C57BL/6小鼠,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。将小鼠饲养于室内相对湿度稳定、温度为23-26℃的环境中,每日明暗环境各12小时,适应性饲养1周后随机分为正常对照（CON）组、EAE模型组、NAD+治疗组。2.EAE小鼠模型的建立。用生理盐水将MOG35-55多肽稀释为10mg/ml,然后加入一定量的结核菌素和等体积的CFA,将其充分混合乳化,调整结核杆菌H37Ra浓度至4 mg/ml,并于小鼠脊柱两侧分4象限依次皮下注射0.1ml的乳剂,并于免疫0 h及第48 h分别腹腔注射0.5 ml百日咳毒素（PTX）。3.药物干预及病情评估。自免疫后第1日,每天给予NAD+治疗组250 mg/kg的剂量腹腔注射。CON组及EAE组小鼠每日腹腔注射等量的PBS。依据Knoz 5分法进行神经功能缺损评分。4.于小鼠发病高峰期,分离出脊髓腰膨大组织制作石蜡切片,分别进行HE及LFB染色进行观察。5.采用qPCR的方法检测脊髓组织IL-1β,IL-17A,IL-10,IFN-γ,IL-2,IL-18和NLRP3的表达情况。6.SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。用ONE-WAY-ANOVA检验多组数据均数的比较,两组比较用SNK-q检验。P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1.NAD+治疗能够降低神经功能缺损评分并延迟发病时间,从而改善EAE的临床表现;2.应用NAD+治疗可以降低EAE的病理学损害,减少脊髓组织的炎症细胞浸润,降低轴索髓鞘损伤;3.在小鼠发病的高峰期取材,采用qPCR的方法检测小鼠脊髓组织中炎症细胞因子的变化。与正常CON组相比,EAE组小鼠中NLRP3炎性小体、IL-1β,IL-17 A,IFN-γ,IL-2和IL-18转录水平明显增高,而NAD+组中NLRP3炎性小体、IL-1β,IFN-γ,IL-2,IL-18和IL-17A转录水平较EAE组小鼠明显降低;与正常CON组相比,EAE组小鼠中IL-10转录水平明显降低,而IL-10在NAD+组转录水平较EAE组明显增高。第二部分 自噬在EAE小鼠发病机制中发挥重要作用目的:在完成EAE动物模型的基础上,分别使用NAD+及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）进行干预,评估不同组小鼠的神经功能缺损评分,通过HE染色、LFB染色病理实验方法检测炎症细胞浸润及脱髓鞘损害,流式细胞学检测脾脏辅助性T淋巴细胞比例的变化,观察阻断自噬后对EAE小鼠相关病变的作用效果。方法:1.选取实验动物及分组。选取体重约18±2g,年龄在6-8周的SPF级雌性C57BL/6小鼠,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。将小鼠饲养于室内相对湿度稳定、温度为23-26℃的环境中,每日明暗交替各12小时,适应性饲养1周后随机分为正常对照（CON）组、EAE模型组、NAD+治疗组、3-MA干预组。2.建立EAE动物模型。用生理盐水将MOG35-55多肽稀释至10 mg/ml,然后加入一定量的结核菌素和等体积的CFA,将其充分混合乳化,调整结核杆菌H37Ra浓度至4 mg/ml,并于小鼠脊柱两侧分4象限依次皮下注射0.1 ml的乳剂,并于免疫0 h及第48 h分两次腹腔注射0.5 ml百日咳毒素（PTX）。3.药物干预及病情评估。3-MA组小鼠给予每日腹腔注射3-MA 10mg/kg;NAD+组小鼠给予每日腹腔注射NAD+250 mg/kg。CON组和EAE组小鼠则每日腹腔注射等体积的PBS缓冲液。采用Knoz 5分法进行神经功能缺损评分。4.于小鼠发病高峰期,分离脊髓腰膨大组织制作石蜡切片,分别进行HE及LFB染色。5.应用流式细胞学检测小鼠脾脏Th1细胞及Th17细胞比例的变化。6.SPSS 21.0软件进行统计学分析。用均数±标准差（x±s）表示计量资料。多组计量资料均数的比较应用ONE-WAY-ANOVA检验,两组比较用SNK-q检验。P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1.抑制自噬加重了EAE的临床症状,使小鼠临床功能缺损评分增加,发病时间提前,并延迟了EAE的自发缓解时间;2.抑制自噬加重了EAE小鼠的病理学表现。3-MA干预组较EAE组小鼠脊髓组织炎症细胞的浸润明显增强;3.同EAE模型组相比,NAD+治疗组显著降低了小鼠脾脏的Th1细胞及Th17细胞的比例,而3-MA干预组较EAE组则明显升高。第三部分 NAD+通过激活自噬并调节NLRP3炎性小体对EAE起保护作用目的:在完成EAE小鼠模型的基础上,分别用NAD+、自噬抑制剂3-MA及NAD+联合3-MA进行处理,观察正常对照CON组、EAE组、NAD+治组、NAD+联合3-MA组神经功能缺损评分的对比,自噬相关蛋白及炎症因子的变化,为NAD+是否通过调节自噬发挥对EAE的抗炎神经保护作用提供实验依据。方法:1.选取实验动物及分组。选取体重约18±2g,年龄在6-8周的SPF级雌性C57BL/6小鼠,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。将小鼠饲养于室内相对湿度稳定、温度为23-26℃的环境中,每日明暗环境各12小时,适应性饲养1周后随机分为正常对照（CON）组、EAE模型组、NAD+治疗组、NAD+与3-MA联合组。2.EAE小鼠模型的建立。用0.9%氯化钠将MOG35-55多肽稀释至10mg/ml,然后加入一定量的结核菌素和等体积的CFA,将其充分混合乳化,调整结核杆菌H37Ra浓度至4 mg/ml,并于小鼠脊柱两侧分4象限依次皮下注射0.1 ml的乳剂,并于免疫0 h及第48 h分别腹腔注射0.5 ml百日咳毒素（PTX）。3.药物干预及病情评估。自免疫后第1天起,每天给予NAD+250mg/kg或/和3-MA 10 mg/kg的剂量腹腔注射。CON组及EAE组小鼠于免疫后的第1天开始,每日腹腔注射等体积的PBS。使用Konoz 5分法进行神经功能缺损评分。4.采用qPCR方法检测各组小鼠脊髓组织IL-1β,NLRP3和IL-17A的表达情况。5.Western blot方法检测脊髓组织自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达情况。6.SPSS 21.0软件进行统计学分析。用均数±标准差（x±s）表示计量资料。多组计量资料均数的比较应用ONE-WAY-ANOVA检验,两组间比较使用SNK-q检验方法。P<0.05则说明具有统计学意义。结果:1.与NAD+组相比,NAD+联合3-MA组小鼠病情加重,神经功能缺损评分增高。2.在小鼠发病高峰期取材,采用qPCR的方法比较各组炎症因子的转录水平。与CON组相比,EAE模型组IL-1β、NLRP3、IL-17A转录水平明显升高,而NAD+治疗组中IL-1β、NLRP3、IL-17A转录水平较EAE模型组明显降低;与NAD+治疗组小鼠相比,NAD+联合3-MA组IL-1β、NLRP3、IL-17A转录水平明显升高。3.采用Western blot方法于小鼠发病高峰期取脊髓腰膨大组织,检测自噬相关蛋白水平。与EAE组小鼠相比,NAD+组增强了EAE小鼠自噬相关蛋白LC3-II/I和Beclin1的表达,同时降低p62的表达。与NAD+组相比,NAD+联合3-MA组LC3-II/I和Beclin1的蛋白表达降低,而p62的蛋白表达增加。第四部分 MOG抗体相关疾病患者急性期及缓解期外周血中NLRP3表达的研究目的:使用qPCR方法检测MOG抗体相关疾病（MOGAD）患者急性期及缓解期外周血中NLRP3炎性小体的转录水平。阐述NLRP3在MOGAD患者急性期及缓解期动态变化情况。方法:1.选取实验对象。2020年9月至2021年2月在河北省儿童医院神经内科住院的诊断为MOGAD患儿20例,诊断标准均符合2020年MOGAD中国专家共识诊断标准。在患者入院后发病急性期且未开始接受糖皮质激素或免疫抑制剂等任何治疗之前,以及病情缓解期复诊时采集患者的外周血标本。2.使用qPCR法检测MOGAD患者急性期及缓解期外周血中的NLRP3的转录水平。3.实验数据采用SPSS 21.0软件分析,计量资料以x±s表示,两组比较采用t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。结果:MOGAD患者急性期血清中的NLRP3炎性小体的转录水平较缓解期显著增高。结论:1.NAD+治疗对EAE小鼠具有神经保护作用。可改善EAE小鼠的临床表现,降低神经功能缺损评分,延迟发病时间,减轻病理学损害,减少炎症因子的分泌,并调节辅助性T细胞的分化。2.自噬在EAE小鼠的发病机制中发挥重要作用。阻断自噬后增加了神经功能缺损评分,使发病时间提前,延迟了EAE的自发缓解,加重了病理学损害,提高了小鼠脾脏Th1及Th17细胞的比例。3.自噬参与了NAD+介导的EAE小鼠的抗炎神经保护作用。NAD+药物治疗可能通过诱导自噬,并降低NLRP3炎性小体的激活及促炎细胞因子的分泌,从而减轻EAE小鼠的疾病严重程度。4.MOGAD患者发病急性期NLRP3炎性小体的表达水平明显高于缓解期,NLRP3炎性小体可能在MOGAD的发病中发挥一定作用,为中枢神经系统免疫炎性脱髓鞘疾病的治疗方案寻找新思路。