论文部分内容阅读
第一部分:细胞周期蛋白CDCA5表达与肝细胞癌患者的临床病理及预后的关系目的:肝癌患者的预后较差,对肝癌细胞周期的研究相对匮乏。在肿瘤细胞周期中,细胞分裂周期相关蛋白5（Cell division cycle associated 5,CDCA5）表达量增高,但其与肝细胞癌患者的临床指标、病理特征及预后的关系仍无相关研究。本部分研究旨在探讨CDCA5表达与肝细胞癌的临床病理关系,及CDCA5与肝细胞癌行根治性切除术患者预后之间的关系。材料与方法:1.临床病理资料:回顾性分析2009年9月至2012年9月原发性肝癌行根治性肝叶切除术患者的临床病理资料。搜集患者临床病理特征、手术后并发症及无瘤生存时间、总生存时间。采用免疫组织化学方法检测肝癌组织、癌旁组织、正常肝脏组织CDCA5表达。依据免疫组化检查结果,将肝癌患者分为CDCA5高表达组、CDCA5低表达组,对比两组患者的临床、病理特征及预后之间的差异。分析患者术后严重并发症（Clavien-Dindo分级Ⅲ-Ⅴ级）发生的危险因素。并分析CDCA5与患者预后的关系,影响患者无瘤生存时间和总生存时间的危险因素。2.免疫组织化学检测CDCA5:CDCA5单克隆抗体购自Abcam公司;二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）浓缩型试剂盒,Goat anti-Rabbit Ig G购自Bioswamp公司。CDCA5单克隆抗体免疫组织化学染色具体实验操作步骤按试剂盒说明书进行。主要染色步骤如下:石蜡切片脱蜡水化,3%H2O2孵育封闭内源性过氧化物酶,高压抗原修复,正常山羊血清封闭,一抗（CDCA5单抗）4℃过夜,PBS冲洗3次,滴加二抗（山羊抗兔Ig G抗体-HRP）,PBS冲洗3次。DAB显色,苏木素淡复染,梯度乙醇脱水,中性树胶封片前采用二甲苯透明,然后显微镜下观察。3.统计学方法:计量资料正态分布数据的表示采用`c±S,非正态分布数据的表示采用中位数（全距）。计量资料正态分布两组间比较采用t检验,非正态分布数据组间比较采用Mann-Whitney U检验。c2检验应用于两组计数资料间的比较。分析CDCA5表达与患者临床病理特征、无瘤生存时间、总生存时间的关系。Logistic回归分析探讨影响患者术后Clavien-Dindo分级Ⅲ-Ⅴ级并发症发生和肝功能衰竭的危险因素。采用log-rank法进行单因素分析,对比组间患者生存时间的差异。多因素分析采用Cox回归法,评价影响患者无瘤生存时间（Recurrence-free Survival,RFS）及总生存时间（Overall Survival,OS）的危险因素。结果:总178例患者纳入本研究,取178例肝癌组织中CDCA5表达半定量评分的中位数,作为CDCA5高表达与低表达的截点。CDCA5高表达患者89例,CDCA5低表达患者89例。两组患者年龄、性别组成、Child-Pugh评分、ALT、ALB、TBIL、AFP、PLT、HBV-DNA、MELD评分对比,差异无统计学意义。CDCA5高表达组患者肿瘤直径较大,微血管侵犯发生率较高。本研究纳入患者术后并发症发生率为37.6%（67例）,术后并发症包括:胆瘘、术后腹腔内出血、肝功能衰竭、胸/腹腔积液、呼吸衰竭、肾功能衰竭、腹腔脓肿、下肢深静脉血栓形成、急性肺动脉栓塞、心功能衰竭、切口并发症等。术后肝功能衰竭总发生率4.5%（8例）。术后30天死亡率为2.2%（4例）。患者30天内死亡原因:急性心肌梗塞1例、肺动脉栓塞1例、C级肝功能衰竭2例。16.9%（30例）患者发生严重并发症（Clavien-Dindo分级Ⅲ-Ⅴ级）,两组患者术后严重并发症发生率差异无统计学意义。单因素分析提示:肿瘤直径、肝硬化是影响患者术后严重并发症的危险因素;肿瘤直径、大范围切肝是影响患者术后肝功能衰竭的危险因素。Logistic回归分析提示,肿瘤直径是影响患者术后严重并发症发生和术后肝功能衰竭的独立危险因素。本研究纳入的患者1、3、5年无瘤生存率为77.0%、55.6%、38.8%;1、3、5年总生存率为89.3%、69.5%、56.0%。CDCA5高表达组患者1、3、5年无瘤生存率为69.7%、46.1%、32.6%;1、3、5年总生存率为86.5%、61.5%、47.8%。CDCA5低表达组患者1、3、5年无瘤生存率为84.3%、64.0%、44.9%;1、3、5年总生存率为89.9%、76.4%、64.0%。CDCA5高表达组患者预后较CDCA5低表达组患者预后差,差异有统计学意义（P<0.05）。单因素分析提示,CDCA5高表达、肝硬化、肿瘤直径、大范围切肝、微血管侵犯是影响患者术后无瘤生存时间和总生存时间的危险因素。Cox回归多因素分析提示,肝硬化、肿瘤直径和微血管侵犯是影响患者术后无瘤生存时间的独立危险因素。肿瘤直径、微血管侵犯是影响肝癌切除术后患者总生存时间的独立危险因素。结论:肝癌组织高表达CDCA5组患者肿瘤直径较大,微血管侵犯发生率较高且预后较差。进一步研究CDCA5在肝癌发生发展过程中的作用机制具有实际的临床价值。第二部分:细胞周期蛋白CDCA5促进肝癌细胞生长作用机制研究目的:CDCA5在肝癌组织中表达增高,且表达量高的患者预后较差。但CDCA5对肝癌细胞生长的调控还缺乏进一步的研究。本部分研究通过细胞实验和动物实验,旨在探讨CDCA5促进肝癌细胞生长的作用机制。材料与方法:1.材料:SMMC-7721、Hep G2、Huh-7肝癌细胞株、DNA凝胶回收试剂盒、LATaq购于武汉华联科生物科技有限公司;去内毒素质粒提取试剂盒购买于OMEG公司;T4 DNA连接酶、内切酶Xho I、Bam H I、Xba I购自NEB公司;慢病毒p Sico R、p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro购自武汉华联科生物科技有限公司;DMEM购自Hyclone公司;青链霉素、胎牛血清购自Gibco公司;PBS、0.25%胰蛋白酶、碘化丙啶购自Bioswamp公司;Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;Lentiviral Packaging Lentiviral Packaging Kit购自上海翊圣生物科技有限公司;Ribonuclease A（RNase A）购自Ta Ka Ra公司;菌种DH5α由武汉华联科生物科技有限公司实验室保存。2.细胞培养和CDCA5检测:SMMC-7721、Hep G2、Huh-7细胞用含有10%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶消化传代培养。Western blot检测CDCA5在以上三种肝癌细胞中的表达。3.实验动物:SPF级BAl B/C-nu/nu裸小鼠,46周龄,体重1820g。购自北京华阜康生物科技股份有限公司。在SPF级动物房内饲养。4.质粒构建:从人肝癌组织中提取总RNA,经反转录为c DNA,以c DNA为模板通过引物（CDCA5-F:GCTCTAGATGTCTGGGAGGCGAACGC、CDCA5-R:CGGGATCCTCATTCAACCAGGAGATCA）扩增CDCA5基因,将目的基因CDCA5及质粒p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro以Xba I、Bam H I双酶切,用T4DNA连接酶将目的基因CDCA5连接到质粒p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro上,转化至DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆,扩大培养后用去内毒质粒提取试剂盒提取质粒,将测序正确的CDCA5过表达质粒命名为p CDH-CDCA5。依据Gen Bank中CDCA5（NM080668.3）的序列,利用sh RNA设计程序,设计3个sh RNA干扰靶点序列（sh CDCA5-1、2、3）。并在5’\3’端分别引入Xho I、Bam HⅠ为酶切位点,按照设计原则合成含干扰序列的双链DNAoligo,将p Sico R载体及合成好的干扰序列双酶切线性化,通过T4DNA连接酶将干扰片段连接到p Sico R载体,转化至DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆,扩大培养后用去内毒质粒提取试剂盒提取质粒,将测序正确的CDCA5干扰质粒命名为p Sico R-sh CDCA5-1、-2、-3。5.基因瞬时转染及鉴定:采用Lipofectamine2000介导的基因转染方法,将构建的敲低质粒转染Hep G2细胞,过表达质粒转染SMMC-7721细胞。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q PCR）及Western blot检测转染效率。6.MTT检测及克隆形成实验:收集CDCA5低表达组,CDCA5过表达组及各阴性对照组对数期细胞。调整细胞悬液浓度,分于96孔板,每孔180μL,每种细胞设3个复孔,并以100μL培养液设空白对照,细胞密度为每孔10005000,37℃孵育过夜。按分组,分别转染12h、24h、48h和72h;取出不同分组的细胞培养板,每孔加20μL MTT溶液（5mg/ml）,再培养4小时。吸弃上清后,150μL DMSO溶解液加入每孔,于摇床上低速振荡10分钟,以使结晶物充分溶解。各孔490 nm吸光值以在酶联免疫检测仪检测。将CDCA5低表达Hep G2细胞、CDCA5过表达SMMC-7721细胞及各组的阴性对照细胞行克隆形成实验。7.流式细胞术检测细胞周期:上述感染的CDCA5低表达组Hep G2细胞,CDCA5过表达组SMMC-7721细胞,及各阴性对照组细胞,用0.25%的胰酶消化并转移至流式细胞管,1000转/分离心5分钟。吸弃上清,用300μL含有10%胎牛血清的PBS溶液悬浮沉淀,移入干净的1.5m L离心管内;加入700μL无水乙醇,置于-20℃冰箱内固定细胞24小时以上。流式细胞术检测其细胞周期变化。8.裸鼠皮下成瘤实验:0.25%胰酶消化并计数上述感染的阴性对照Hep G2细胞,CDCA5低表达组Hep G2细胞,用无血清培养基调整细胞浓度为1x107个/ml。每只小鼠皮下注射0.2ml各组细胞,自接种之日起每天观察裸鼠状态,成瘤时间及瘤体生长情况。第30天处死裸鼠,取出肿瘤,称重并对比每组肿瘤组织的平均重量。9.统计学分析:正态分布计量资料的表示采用`c±S表示,非正态分布计量资料表示采用中位数（全距）。计量正态分布两组间比较采用t检验,多组计量数据间比较采用单因素方差分析,非正态分布采用Mann-Whitney U检验。计数资料两组间的对比采用c2检验。采用双侧检验,P<0.05认为有统计学差异。统计学运算采用SPSS软件（IBM version 22.0,NY,USA）。结果:1.质粒构建及转染:Western blot检测到CDCA5在肝癌Hep G2细胞株的表达量显著高于SMMC-7721、Huh-7细胞株,故选用Hep G2细胞株进行后续RNA干扰敲低实验。Western blot检测sh CDAC5-3质粒敲低最明显,故选取sh CDAC5-3质粒进行后续实验。取表达量最低的SMMC-7721细胞株进行CDCA5过表达实验。sh CDCA5-3质粒敲低CDCA5以及p CDH-CDCA5质粒转染过表达CDCA5后,Western blot检测CDCA5相对表达量分别为0.30、1.01。2.MTT检测:MTT检测经敲低和过表达CDCA5后Hep G2细胞和SMMC-7721细胞生长情况。经转染12、24、48、72小时后,敲低组Hep G2细胞抑制率分别为（8.40±2.07）%、（14.10±0.53）%、（65.97±0.58）%、（70.10±1.04）%。随着转染时间延长,CDCA5敲低组Hep G2肝癌细胞增殖率明显受抑制;过表达组SMMC-7721细胞存活率分别为（102.83±1.56）%、（116.23±1.01）%、（128.93±0.95）%、（130.03±0.35）%。随着转染时间延长,CDCA5过表达组SMMC-7721肝癌细胞存活率明显增强。3.细胞平板克隆形成实验:CDCA5敲低后,Hep G2细胞克隆形成率（16.40±1.75）%,而阴性对照组细胞克隆形成率为（32.17±3.25）%（P<0.05）。CDCA5敲低后,Hep G2细胞增殖能力减弱,形成的克隆数目较少。CDCA5过表达后,SMMC-7721细胞克隆形成率为（51.93±3.46）%,而阴性对照组细胞克隆形成率为（34.57±4.86）%（P<0.05）。CDCA5过表达后,SMMC-7721细胞增殖能力增强,形成的克隆数目增多。4.流式细胞术检测细胞周期:流式细胞术检测CDCA5敲低组、阴性对照组Hep G2肝癌细胞周期。与阴性对照组Hep G2细胞相比,CDCA5敲低组G2期细胞明显增多,提示敲低CDCA5后,肝癌Hep G2细胞生长的抑制是在G2期被阻滞。p CDH-CDCA5过表达CDCA5的SMMC-7721细胞与阴性对照SMMC-7721细胞相比,细胞周期差异无明显变化。5.裸鼠皮下成瘤实验:裸鼠皮下注射阴性对照Hep G2细胞及CDCA5低表达的Hep G2细胞。注射阴性对照Hep G2细胞组的裸鼠,平均第5天皮下出现肿瘤;而注射CDCA5低表达组肝癌Hep G2细胞的裸鼠,平均第6天皮下出现肿瘤。注射第30天,阴性对照Hep G2细胞组、CDCA5低表达组裸鼠瘤体重量分别为0.89±0.07克,0.66±0.11克。CDCA5低表达组瘤体重量明显低于阴性对照Hep G2细胞组,两组间对比有统计学差异（P<0.05）。免疫组化检测CDCA5在小鼠成瘤组织中的表达提示,CDCA5在低表达组肿瘤组织中表达降低（P<0.05）。结论:CDCA5能明显促进肝癌细胞的增殖能力,通过调控CDCA5对抑制肝癌细胞的生长有一定意义。进一步研究可针对CDCA5调控肝癌细胞增殖的相关信号通路来进行。第三部分:CDCA5促进肝癌细胞生长的信号转导机制研究目的:为了进一步分析CDCA5在致癌过程中的作用,我们关注可能磷酸化CDCA5的蛋白,及可能参与的信号通路。在肺癌的研究中发现,CDCA5被ERK磷酸化。本部分研究旨在探讨CDCA5促进肝癌细胞生长的信号转导机制。材料与方法:1.材料:Hep G2肝癌细胞株购自武汉华联科生物科技有限公司。U0126购自Biovison公司。ERK1、ERK2、CDCA5兔抗人抗体购自Abcam公司;phospho-p44/42MAPK（e RK1/2）（t HR202/t YR204）、GAPDH兔抗人抗体购自Cell Signaling Technology公司;二抗Goat anti rabbit Ig G购自Bioswamp公司。2.细胞培养:采用含10%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM培养基,于37℃、5%CO2培养箱中进行Hep G2细胞培养。0.25%胰蛋白酶消化传代培养。3.EGF及U0126刺激Hep G2细胞:EGF为MAPK信号通路激活剂,U0126为MEK抑制剂。实验组以50ng/m L浓度的EGF和10mmol/L浓度的U0126共同刺激肝癌Hep G2细胞。对照组仅以50ng/m L浓度的EGF刺激Hep G2细胞。分别刺激15分钟、30分钟、60分钟。4.Western blot检测ERK1、ERK2、p-ERK1/2和CDCA5表达:离心搜集细胞,在细胞中加入蛋白裂解混合液,4℃充分裂解细胞。12000g离心5分钟,取上清进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。以Western blot检测ERK1、ERK2、p-ERK1/2和CDCA5表达。5.统计学分析:采用Image J软件计算Western blot测得的蛋白表达灰度值,以目的蛋白测定值与GAPDH比值作为蛋白相对表达量。所有统计采用SPSS软件进行统计学运算。结果:1.EGF刺激肝癌Hep G2细胞对ERK1、ERK2、p ERK1/2和CDCA5表达的影响:EGF刺激肝癌Hep G2细胞后,在刺激的15分钟、30分钟,p ERK1/2表达明显上调,而CDCA5随着EGF刺激时间延长而表达逐渐增加。EGF刺激的第60分钟,p ERK1/2表达量较EGF刺激15分钟、30分钟降低。EGF刺激Hep G2细胞后,Western blot检测总ERK1、ERK2变化无显著性差异。2.EGF和U0126刺激肝癌Hep G2细胞对ERK1、ERK2、p ERK1/2和CDCA5表达的影响:U0126可抑制EGF所刺激的p ERK1/2表达,而CDCA5表达量也随着p ERK1/2表达降低而逐渐降低。EGF及U0126共刺激Hep G2细胞后,Western blot检测总ERK1、ERK2变化无显著性差异。结论:CDCA5随p ERK1/2的变化而变化,提示CDCA5可能参与MAPK信号通路,并可能被p ERK1/2所调控。