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第一部分VEGFR3在胃癌组织中的表达及与临床病理特征分析
目的:
检测VEGFR3在早期胃癌和进展期胃癌组织中的表达情况，并进一步分析VEGFR3表达与胃癌患者的临床病理学的关系。
方法:
从TCGA数据库中收集VEGFR3在胃癌组织中表达的相关资料，进行分析。用免疫组织化学方法检测50例早期胃癌组织、48例进展期胃癌及其配对正常胃粘膜组织中VEGFR3蛋白表达情况，应用统计学方法分别分析VEGFR3的蛋白表达与早期胃癌、进展期胃癌患者的临床病理学关系
结果:
1.数据库分析结果
VEGFR3在胃癌组织中表达上调;VEGFR3高表达组的患者预后比VEGFR3低表达组的预后差。随着胃癌患者临床分期、病理分期级别的升高及淋巴结转移数目的增加，与对照组(即正常胃粘膜组织)相比VEGFR3的表达水平随之升高。
2.免疫组织化学结果
早期胃癌和进展期胃癌组织中VEGFR3蛋白的阳性表达率(60％和93.75％)明显高于正常胃粘膜组织(10％)。在早期胃癌组织中VEGFR3蛋白的表达与肿瘤的浸润深度和淋巴结转移有关，与患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤分化程度均无关:在进展期胃癌中VEGFR3表达高低仅与胃癌患者淋巴结有无转移密切相关，与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤浸润深度及分化程度均无关;且VEGFR3的高表达组患者生存预后较差。
结论:
VEGFR3在早期胃癌及进展期胃癌中表达均上调，且与胃癌患者的淋巴结转移状况及不良预后有关。
第二部分VEGFR3对胃癌细胞生物学功能的影响
目的:
通过体外细胞学和体内动物学实验观察VEGFR3对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学功能的影响。
方法:
1.体外实验
在胃癌细胞系中分别转染VEGFR3的小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒，用quantitativeReal-timePCR和Westernblot检测转染后胃癌细胞系中VEGFR3的表达效果。应用Edu和平板克隆实验检测转染VEGFR3后胃癌细胞株的增殖能力变化;划痕实验和Transwell小室实验来检测转染VEGFR3后胃癌细胞的迁移和侵袭能力的变化;流式细胞仪检测转染VEGFR3后胃癌细胞的凋亡情况和对细胞周期时相分布的影响。
2.体内实验
构建以慢病毒为载体的敲低VEGFR3表达的稳转胃癌细胞系(MKN45)并扩增胃癌细胞。通过皮下和尾静脉注射的方法将感染慢病毒的胃癌细胞注射到裸鼠体内。5-8周后观察裸鼠皮下成瘤情况及肿瘤向远处脏器的转移情况来分析VEGFR3在体内对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响。
结果:
1.RT-qPCR和Westernblot结果
MKN45和BGC823胃癌细胞分别转染小干扰RNA(siRNA)后，VEGFR3在mRNA和蛋白水平表达明显低于对照组;而MGC803胃癌细胞转染过表达质粒后，VEGFR3在mRNA和蛋白水平表达明显高于对照组。
2.VEGFR3对胃癌细胞生物学功能的影响
体外细胞学实验表明敲低VEGFR3表达(即转染VEGFR3的siRNA)后明显抑制了胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力和细胞周期从G1期到S期的转换，促进了胃癌细胞的凋亡;而VEGFR3过表达(即转染过表达质粒)后促进了胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力、促进了细胞周期从G1期到S期的转换，抑制了胃癌细胞的凋亡。
体内动物实验表明敲低VEGFR3的表达后，裸鼠皮下瘤的生长速度明显减慢，皮下瘤的体积和重量与对照组相比明显变小，且包膜浸润情况也减少。在尾静脉注射模型中发现，敲低VEGFR3表达后，肺脏中转移瘤的数目和大小明显减少。
结论:
体内动物和体外细胞学实验均表明VEGFR3的表达与胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力呈正相关;体外细胞学实验还表明VEGFR3的表达与胃癌细胞的凋亡呈负相关;对胃癌细胞周期的作用集中在从G1期-S期。
第三部分VEGFR3对胃癌细胞功能影响的分子机制
目的:
探讨VEGFR3对胃癌细胞增殖、侵袭及凋亡能力影响的分子机制。
方法:
应用Weseternblot方法检测转染VEGFR3的胃癌细胞系中PI3K/AKT通路，上皮间质转化通路和内源性细胞凋亡通路中相关基因的表达情况。
结果:
胃癌细胞中敲低和过表达VEGFR3后，对PI3K/AKT的蛋白表达影响不大，而与磷酸化的PI3K/AKT的蛋白表达水平呈正相关;敲低VEGFR3的表达，N-钙黏素(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达下调，E-钙黏素(E-cadherin)的表达上调，而过表达VEGFR3后，E-钙黏素(E-cadherin)的表达下调，N-钙黏素(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达上调;敲低VEGFR3表达后，BLC2蛋白的表达明显减少，而BAX、Parp、Caspase3蛋白的表达明显增加，而过表达VEGFR3后，BAX、Parp、Caspase3蛋白表达明显减少，而BCL2蛋白的表达明显增加。
结论:
VEGFR3通过影响PI3K/AKT信号通路的磷酸化影响胃癌细胞的生物学功能;通过影响上皮间质转化信号通路基因的表达影响胃癌细胞的迁移和侵袭;通过影响BAX/BCL2和Capase3/PARP两条内源性凋亡通路影响胃癌细胞的凋亡。
第四部分敲低VEGFR3表达后胃癌细胞中差异基因和信号通路分析
目的:
通过高通量测序分析敲低VEGFR3表达的胃癌细胞中的差异表达基因及其调控的相关信号通路，进一步分析VEGFR3对下游信号通路的影响，以寻找影响胃癌治疗策略的新方向。
方法:
1、对慢病毒转染VEGFR3的胃癌细胞中基因的mRNA进行二代测序分析，筛选出影响显著的差异表达基因及信号通路。
2、应用RT-qPCR和Westernblot分别检测敲低VEGFR3的胃癌细胞中已筛选出的信号通路中相关基因的表达情况。
结果:
1.二代测序结果发现敲低VEGFR3表达后MKN45胃癌细胞有729个上调基因，803个下调基因，通过KEGG富集分析发现差异基因集中在Notch信号通路。
2.RT-qPCR和Westernblot实验结果发现敲低VEGFR3表达后，在胃癌细胞(MKN45和BGC823)中CREBBP、DLL4、Hey1、MAML1和Nrarp基因表达下调;这表明下调VEGFR3对Notch信号通路有抑制作用。
结论:
在MKN45胃癌细胞中敲低VEGFR3的表达后对Notch信号通路影响显著，敲低VEGFR3表达，对Notch信号通路起到一定的抑制作用。
第五部分胃癌中VEGFR3启动子甲基化与其表达的关系
目的:
检测早期胃癌组织及胃癌细胞中VEGFR3基因启动子甲基化状态，分析其甲基化状态与早期胃癌患者的临床病理学的关系，进而探讨影响VEGFR3表达的表观遗传调控机制。
方法:
应用MSP技术检测早期胃癌组织及其配对正常胃粘膜组织中VEGFR3基因启动子甲基化状态，分析VEGFR3基因启动子甲基化与早期胃癌的临床病理学关系。同时应用MSP技术、RT-qPCR技术和Westernblot技术检测应用不同浓度5-Aza-CdR药物处理胃癌细胞株(MGC823)前后VEGFR3的启动子甲基化状态及其mRNA和蛋白表达水平变化。
结果:
早期胃癌组织中VEGFR3启动子的甲基化发生频率(48％)明显低于正常胃粘膜(85％)，且VEGFR3蛋白高表达与VEGFR3基因启动子低甲基化密切相关。VEGFR3基因启动子的甲基化状态与淋巴结转移有关(P＜0.05)，与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度及肿瘤浸润深度无关(P＞0.05)。应用10μmol/L浓度的5-Aza-CdR药物处理胃癌细胞系(MGC823)后，VEGFR3启动子的异常甲基化出现逆转，同时胃癌细胞中VEGFR3的mRNA和蛋白表达均增加。
结论:
早期胃癌组织中，VEGFR3基因启动子的低甲基化状态是VEGFR3过度表达的主要机制，且与胃癌患者的淋巴结转移有关;使用药物5-Aza-CdR可逆转胃癌细胞的甲基化状态，使VEGFR3的mRNA及蛋白表达增加。
目的:
检测VEGFR3在早期胃癌和进展期胃癌组织中的表达情况，并进一步分析VEGFR3表达与胃癌患者的临床病理学的关系。
方法:
从TCGA数据库中收集VEGFR3在胃癌组织中表达的相关资料，进行分析。用免疫组织化学方法检测50例早期胃癌组织、48例进展期胃癌及其配对正常胃粘膜组织中VEGFR3蛋白表达情况，应用统计学方法分别分析VEGFR3的蛋白表达与早期胃癌、进展期胃癌患者的临床病理学关系
结果:
1.数据库分析结果
VEGFR3在胃癌组织中表达上调;VEGFR3高表达组的患者预后比VEGFR3低表达组的预后差。随着胃癌患者临床分期、病理分期级别的升高及淋巴结转移数目的增加，与对照组(即正常胃粘膜组织)相比VEGFR3的表达水平随之升高。
2.免疫组织化学结果
早期胃癌和进展期胃癌组织中VEGFR3蛋白的阳性表达率(60％和93.75％)明显高于正常胃粘膜组织(10％)。在早期胃癌组织中VEGFR3蛋白的表达与肿瘤的浸润深度和淋巴结转移有关，与患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤分化程度均无关:在进展期胃癌中VEGFR3表达高低仅与胃癌患者淋巴结有无转移密切相关，与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤浸润深度及分化程度均无关;且VEGFR3的高表达组患者生存预后较差。
结论:
VEGFR3在早期胃癌及进展期胃癌中表达均上调，且与胃癌患者的淋巴结转移状况及不良预后有关。
第二部分VEGFR3对胃癌细胞生物学功能的影响
目的:
通过体外细胞学和体内动物学实验观察VEGFR3对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学功能的影响。
方法:
1.体外实验
在胃癌细胞系中分别转染VEGFR3的小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒，用quantitativeReal-timePCR和Westernblot检测转染后胃癌细胞系中VEGFR3的表达效果。应用Edu和平板克隆实验检测转染VEGFR3后胃癌细胞株的增殖能力变化;划痕实验和Transwell小室实验来检测转染VEGFR3后胃癌细胞的迁移和侵袭能力的变化;流式细胞仪检测转染VEGFR3后胃癌细胞的凋亡情况和对细胞周期时相分布的影响。
2.体内实验
构建以慢病毒为载体的敲低VEGFR3表达的稳转胃癌细胞系(MKN45)并扩增胃癌细胞。通过皮下和尾静脉注射的方法将感染慢病毒的胃癌细胞注射到裸鼠体内。5-8周后观察裸鼠皮下成瘤情况及肿瘤向远处脏器的转移情况来分析VEGFR3在体内对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响。
结果:
1.RT-qPCR和Westernblot结果
MKN45和BGC823胃癌细胞分别转染小干扰RNA(siRNA)后，VEGFR3在mRNA和蛋白水平表达明显低于对照组;而MGC803胃癌细胞转染过表达质粒后，VEGFR3在mRNA和蛋白水平表达明显高于对照组。
2.VEGFR3对胃癌细胞生物学功能的影响
体外细胞学实验表明敲低VEGFR3表达(即转染VEGFR3的siRNA)后明显抑制了胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力和细胞周期从G1期到S期的转换，促进了胃癌细胞的凋亡;而VEGFR3过表达(即转染过表达质粒)后促进了胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力、促进了细胞周期从G1期到S期的转换，抑制了胃癌细胞的凋亡。
体内动物实验表明敲低VEGFR3的表达后，裸鼠皮下瘤的生长速度明显减慢，皮下瘤的体积和重量与对照组相比明显变小，且包膜浸润情况也减少。在尾静脉注射模型中发现，敲低VEGFR3表达后，肺脏中转移瘤的数目和大小明显减少。
结论:
体内动物和体外细胞学实验均表明VEGFR3的表达与胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力呈正相关;体外细胞学实验还表明VEGFR3的表达与胃癌细胞的凋亡呈负相关;对胃癌细胞周期的作用集中在从G1期-S期。
第三部分VEGFR3对胃癌细胞功能影响的分子机制
目的:
探讨VEGFR3对胃癌细胞增殖、侵袭及凋亡能力影响的分子机制。
方法:
应用Weseternblot方法检测转染VEGFR3的胃癌细胞系中PI3K/AKT通路，上皮间质转化通路和内源性细胞凋亡通路中相关基因的表达情况。
结果:
胃癌细胞中敲低和过表达VEGFR3后，对PI3K/AKT的蛋白表达影响不大，而与磷酸化的PI3K/AKT的蛋白表达水平呈正相关;敲低VEGFR3的表达，N-钙黏素(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达下调，E-钙黏素(E-cadherin)的表达上调，而过表达VEGFR3后，E-钙黏素(E-cadherin)的表达下调，N-钙黏素(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达上调;敲低VEGFR3表达后，BLC2蛋白的表达明显减少，而BAX、Parp、Caspase3蛋白的表达明显增加，而过表达VEGFR3后，BAX、Parp、Caspase3蛋白表达明显减少，而BCL2蛋白的表达明显增加。
结论:
VEGFR3通过影响PI3K/AKT信号通路的磷酸化影响胃癌细胞的生物学功能;通过影响上皮间质转化信号通路基因的表达影响胃癌细胞的迁移和侵袭;通过影响BAX/BCL2和Capase3/PARP两条内源性凋亡通路影响胃癌细胞的凋亡。
第四部分敲低VEGFR3表达后胃癌细胞中差异基因和信号通路分析
目的:
通过高通量测序分析敲低VEGFR3表达的胃癌细胞中的差异表达基因及其调控的相关信号通路，进一步分析VEGFR3对下游信号通路的影响，以寻找影响胃癌治疗策略的新方向。
方法:
1、对慢病毒转染VEGFR3的胃癌细胞中基因的mRNA进行二代测序分析，筛选出影响显著的差异表达基因及信号通路。
2、应用RT-qPCR和Westernblot分别检测敲低VEGFR3的胃癌细胞中已筛选出的信号通路中相关基因的表达情况。
结果:
1.二代测序结果发现敲低VEGFR3表达后MKN45胃癌细胞有729个上调基因，803个下调基因，通过KEGG富集分析发现差异基因集中在Notch信号通路。
2.RT-qPCR和Westernblot实验结果发现敲低VEGFR3表达后，在胃癌细胞(MKN45和BGC823)中CREBBP、DLL4、Hey1、MAML1和Nrarp基因表达下调;这表明下调VEGFR3对Notch信号通路有抑制作用。
结论:
在MKN45胃癌细胞中敲低VEGFR3的表达后对Notch信号通路影响显著，敲低VEGFR3表达，对Notch信号通路起到一定的抑制作用。
第五部分胃癌中VEGFR3启动子甲基化与其表达的关系
目的:
检测早期胃癌组织及胃癌细胞中VEGFR3基因启动子甲基化状态，分析其甲基化状态与早期胃癌患者的临床病理学的关系，进而探讨影响VEGFR3表达的表观遗传调控机制。
方法:
应用MSP技术检测早期胃癌组织及其配对正常胃粘膜组织中VEGFR3基因启动子甲基化状态，分析VEGFR3基因启动子甲基化与早期胃癌的临床病理学关系。同时应用MSP技术、RT-qPCR技术和Westernblot技术检测应用不同浓度5-Aza-CdR药物处理胃癌细胞株(MGC823)前后VEGFR3的启动子甲基化状态及其mRNA和蛋白表达水平变化。
结果:
早期胃癌组织中VEGFR3启动子的甲基化发生频率(48％)明显低于正常胃粘膜(85％)，且VEGFR3蛋白高表达与VEGFR3基因启动子低甲基化密切相关。VEGFR3基因启动子的甲基化状态与淋巴结转移有关(P＜0.05)，与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度及肿瘤浸润深度无关(P＞0.05)。应用10μmol/L浓度的5-Aza-CdR药物处理胃癌细胞系(MGC823)后，VEGFR3启动子的异常甲基化出现逆转，同时胃癌细胞中VEGFR3的mRNA和蛋白表达均增加。
结论:
早期胃癌组织中，VEGFR3基因启动子的低甲基化状态是VEGFR3过度表达的主要机制，且与胃癌患者的淋巴结转移有关;使用药物5-Aza-CdR可逆转胃癌细胞的甲基化状态，使VEGFR3的mRNA及蛋白表达增加。