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目的: Mig-14作为细菌中一种重要的调节因子,在沙门菌入侵宿主和抵抗多粘菌素B的杀伤作用方面有重要作用,但其在伤寒沙门菌中的具体功能和机制还不清楚。本论文旨在研究Mig-14在伤寒沙门菌中的相关功能及其作用机制。 方法: 1.伤寒沙门菌的动力实验:从LB平板上用无菌牙签挑取野生株与mig-14缺陷株单菌落接种在0.3%的半固体LB平板上,37℃培养8h后,测量动力圈大小比较两者的动力。 2.伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力分析:将野生株与mig-14缺陷株培养至对数期(OD6000.4),加入培养有HeLa细胞的24孔板中(MOI均为20)。培养90 min后将部分孔的细胞破膜,收集菌体后涂板过夜,菌落数代表细菌粘附细胞水平(T0);对另一部分细胞加入庆大霉素继续培养90 min后,破膜涂板过夜,菌落数代表细菌侵袭水平(T90),以T90/T0值代表细菌的侵袭力。 3.伤寒沙门菌在THP-1细胞内生存力分析:将野生株与mig-14缺陷株培养至对数期(OD6000.4),加入到有THP-1细胞的24孔板中(MOI均为10)。培养1h后,加入庆大霉素作用1h,将其中一部分孔的细胞破膜,收集细菌涂板,计数菌落数(T0)代表基础吞噬细菌水平;剩余孔内的细胞培养12或24 h后,破膜收集细菌涂板,菌落数(T12或T24)作为细菌在胞内的增殖水平,T12/T0和T24/T0代表细菌在THP-1细胞内的生存能力。 4.多粘菌素B环境下细菌生长的观察:以生长时间为横坐标,OD600值为纵坐标绘制生长曲线,比较野生株与mig-14缺陷株两者在多粘菌素B培养条件下的生长差异。 5.qRT-PCR分析细菌基因表达水平:将野生株与mig-14缺陷株在含多粘菌素B的LB培养基中培养5h,Trizol法提取总RNA,特异性逆转录后通过qRT-PCR分析两种菌株间的基因表达差异。 6.Mig-14蛋白分段表达:构建pET22b(+)-mig-14-p重组质粒,热击导入BL-21表达菌中,培养至OD6000.6后加入IPTG诱导细菌表达重组蛋白Mig-14-p,利用KCl染色切胶法纯化目的蛋白Mig-14-p,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白纯度。 7.Mig-14-p抗血清的制备:将重组蛋白Mig-14-p与等体积的弗氏完全佐剂研磨乳化后,于兔子背部皮下注射1mL,21天后,用Mig-14-p与弗氏不完全佐剂研磨形成的乳化抗原同样免疫家兔,此后每隔10天加强免疫一次。ELISA检测抗体效价达到104以上时终止免疫,并用免疫印迹法测定抗血清的特异性。 8.免疫共沉淀实验:收集伤寒沙门菌野生株在高渗(30 min)和多粘菌素B(30 min)条件下的细菌总蛋白,利用自制的抗Mig-14-p的抗血清进行免疫共沉淀实验,探究是否存在与Mig-14相互作用的蛋白。 9.凝胶阻滞实验:将由公司制备的Mig-14-c蛋白与ompF、 invF的启动子区域的DNA片段进行孵育,用6%丙烯酰胺胶电泳来检测二者的结合情况,探讨Mig-14是否能够直接调控这两个基因。 结果: 1.动力实验表明,mig-14缺陷株比野生株细菌动力增加。 2.与野生株相比,mig-14缺陷株对上皮细胞的侵袭力有所降低。 3.与野生株相比,mig-14缺陷株在THP-1细胞内的生存能力下降。 4.生长曲线表明,在多粘菌素B培养条件下,伤寒沙门菌mig-14缺陷株与野生株相比,生长缓慢。 5.qRT-PCR结果显示,在多粘菌素B培养条件下,Mig-14可以上调iagA、invF基因的表达,下调figD、ompC、 ompF基因的表达。 6.成功制备了Mig-14-p和Mig-14-c重组蛋白。 7.成功制备了Mig-14-p抗血清,其效价为1∶64000。 8.免疫共沉淀结果提示未发现与Mig-14相结合的蛋白。 9.凝胶阻滞试验表明Mig-14-c可能不能与ompF、 invF启动子区域直接结合。 结论: 伤寒沙门菌中,mig-14基因的缺陷能够影响细菌的动力、对上皮细胞的侵袭力、在巨噬胞内的生存力及抵抗多粘菌素的能力,制备了重组蛋白Mig-14-p和Mig-14-c并获得了兔抗Mig-14-p的抗血清,为进一步研究Mig-14的功能奠定了基础。