前言甲基汞(methylmercury)是一种具有神经毒性的环境污染物,可通过食物链产生生物放大作用。对人类造成危害,损害的主要部位是大脑的枕叶(距状区视觉中枢)和小脑,对成人可导致记忆丧失,对儿童、婴幼儿可造成语言和记忆能力短缺等。目前,氯化甲基汞中毒致神经损伤机制多是对即早基因、肽类和单胺类神经递质进行研究。谷氨酸(glutamate,Glu)是哺乳动物脑内最重要的兴奋性氨基酸,有研究提出氯化甲基汞中毒可能与脑内谷氨酸代谢和传递异常有关,但其机制上不明确。虽然神经细胞内有谷氨酰胺合成酶(glutamine synthesis, GS)可将谷氨酸转变成谷氨酰胺(glutamine,Gln),但星形胶质细胞的高亲和力谷氨酸转运体对谷氨酸的再摄取、维持谷氨酸代谢平衡起到至关重要的作用,星形胶质细胞膜上主要表达2种高亲和性Glu转运体——GLAST(glutamate aspartate transporter, EAAT 1)和GLT—1(glutamate transporter 1, EAAT 2),二者均能逆浓度梯度将Glu从胞外转运至胞内,从而及时终止突触部位Glu的兴奋性传导并维持其胞外的稳态水平。神经胶质细胞生成的Gln,通过细胞间隙运送到神经元内,经磷酸活化谷氨酰胺酶(phosphate activated glutaminase,PAG)水解生成Glu。因此氯化甲基汞中毒引起的神经毒性很可能通过影响谷氨酸转运体、谷氨酰胺合成酶及经磷酸活化谷氨酰胺酶活性有关。同时,有研究表明,过量Glu可诱导的神经元Ca2+内流,而Ca2+超载可刺激星形胶质细胞中产生活力氧,因此氯化甲基汞神经毒性导致谷氨酸代谢异常和氧化损伤可能会有一定的关系。右美沙芬是一种NMDA受体非竞争性拮抗剂,有研究表明其可阻断谷氨酸过量对NMDA受体的活化,抑制了钙离子内流。利鲁唑是一种钠离子通道抑制剂,又是谷氨酸释放抑制剂,有研究表明,利鲁唑的作用机制可能与促进谷氨酸摄取,增强其与谷氨酸转运体结合的作用有关。但是,目前应用右美沙芬和利鲁唑干预氯化甲基汞所致神经损伤的研究,鲜有报道。本研究拟通过体内与体外实验相结合的方法,首先,研究右美沙芬和利鲁唑对氯化甲基汞致大鼠大脑皮质神经毒性及氧化损伤的影响,再研究利鲁唑对氯化甲基汞致星形胶质细胞谷氨酸代谢和转运障碍的影响。材料与方法一、体内动物实验1、实验动物与分组由中国医科大学实验动物中心提供实验用清洁级Wistar大鼠40只,体重180±10克,雌雄各半。动物室温度17-23℃,相对湿度45-55%,动物饲料由实验动物中心提供。正式实验前适应性喂养1周,按体重随机分成5组,每组8只。第1组为对照组,第2-3组分别为低、高剂量染氯化甲基汞组,第4组为右美沙芬预处理组,第5组为利鲁唑预处理组。第1-3组均皮下注射生理盐水,第4组皮下注射13.5μmol/kg右美沙芬,第5组皮下注射21.35μmol/kg利鲁唑。2小时后,第1组腹腔注射生理盐水,第2、3组分别腹腔注射4、12μmol/kg氯化甲基汞,第4、5组均腹腔注射12μmol/kg氯化甲基汞,注射容量均为5ml/kg。连续染毒4周,每周5次,每天1次,隔日干预1次。最后一次注射后24 h,将大鼠用乙醚麻醉,心脏放血后,切取大脑皮质。2、测定指标测汞含量用冷原子吸收法；Glu和Gln的含量按照南京建成试剂盒说明进行测定；GS活力测定用RENIS等描述的γ-谷氨酰转移酶的非生理学催化反应；PAG活力测定用CURI等的方法；丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量测定用硫代巴比妥酸比色法；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)用黄嘌呤氧化酶法测定；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性用DTNB比色法测定；蛋白含量测定用Folin-Lowry法。二、体外神经胶质细胞培养(一)神经胶质细胞培养及鉴定参照Hertz等的方法进行星形胶质细胞培养,应用GFAP免疫细胞化学反应进行细胞鉴定,阳性率达95%后进行实验。(二)测定指标1、细胞活力测定及分组通过MTT法分析,暴露于氯化甲基汞(0-40μM)4-24小时后细胞毒性的变化和利鲁唑(50-200μM)预处理4-24小时后的干预作用,并选择适当且有代表性的染毒和干预剂量和时间；使用倒置相差显微镜观察细胞形态学改变。2、星形胶质细胞GS、GLAST和GLT-1mRNA和蛋白表达的测定应用RT-PCR法检测GS、GLAST、GLT-1的基因表达,用G3PDH作内参；应用Western blot法检测GS、GLAST及GLT-1的蛋白表达,用β-actin作内参。三、统计学分析用SPSS 11.5软件进行数据处理,实验所得数据以平均值±标准差表示,采用单因素方差分析进行组间差异的显著性检验,两组间比较用Q检验(Students-Newman-Keuls, SNK)。结果一、体内动物实验与对照组相比,随着染氯化甲基汞剂量的增加,大鼠大脑皮质中Hg、Glu和MDA含量增加,PAG活力逐渐增加；Gln含量下降,GSH-Px、SOD和GS活力下降。与12μmol/kg氯化甲基汞组相比,右美沙芬和利鲁唑预处理组中,大鼠大脑皮质Hg、Glu和MDA含量下降,PAG活力下降；Gln含量增加,GSH-Px、SOD和GS的活力增加。二、体外神经胶质细胞培养原代培养的星形胶质细胞,经GFAP免疫细胞化学染色鉴定后,阳性率95%。通过MTT法观察氯化甲基汞对星形胶质细胞有细胞毒性作用。与对照组相比,随着染氯化甲基汞剂量的增高(0-40μM)4-24小时后星形胶质细胞的形态损伤程度逐渐增加及膜的完整性逐渐下降,并表现出一定的剂量和时间依赖性的效应关系,选定氯化甲基汞染毒剂量为0、1、10、20μM,染毒时间为12小时；与20μM氯化甲基汞的剂量水平上相比,利鲁唑(50-200μM)预处理4-24小时后星形胶质细胞形态学损伤出现不同程度的减轻,确定利鲁唑干预剂量为100μM,干预时间为12小时；氯化甲基汞0-20μM染毒组之间,GSmRNA和蛋白表达差异没有显著性, GLAST及GLT-1的mRNA和蛋白表达逐渐下降。与氯化甲基汞(0-20μM)染毒组相比,利鲁唑100μM预处理12小时,细胞形态学损伤减轻程度明显,除GS外,GLAST及GLT-1的mRNA和蛋白表达有所增加。结论1、通过对大鼠腹腔注射氯化甲基汞溶液成功建立了氯化甲基汞中毒的大鼠模型,发现氯化甲基汞染毒可在大脑皮质中蓄积,破坏大脑皮质中“谷氨酸-谷氨酰胺循环”,导致大脑皮质谷氨酸代谢异常,产生神经毒性作用。同时其还可以引起大脑皮质的氧化损伤。2、通过体内实验发现,右美沙芬和利鲁唑对氯化甲基汞引起的神经毒性和氧化损伤具有一定的拮抗作用。3、通过体外星形胶质细胞实验发现,氯化甲基汞对神经胶质细胞具有明显的毒性,其可导致谷氨酸转运体功能及谷氨酸代谢障碍。4、通过体外星形胶质细胞实验发现,利鲁唑对氯化甲基汞暴露造成的星形胶质细胞谷氨酸代谢和转运异常具有一定的拮抗作用。