新型融合蛋白PTD-GRB2-SH2和乳腺癌Ras信号转导的相关研究

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生长因子受体连接蛋白2(Grb2)是由一个中央的SH2结构域和两个两端的SH3结构域组成,一端通过SH2结构域激活受体酪氨酸激酶(RTK),另一端通过SH3结构域结合鸟嘌呤核苷酸交换因子(SOS),进一步激活下游通路信号分子,启动MAPK级联反应,参与到肿瘤信号转导过程中。本实验从Ras信号通路中的重要分子Grb2的SH2结构域切入,以基因到蛋白水平两种不同层次的干预方式为结合点,重点阐明Grb2-SH2结构域在乳腺癌细胞中的功能和地位,并采取基因重组的方法构建含有Grb2-SH2结构域和PTD结构域的融合蛋白,构建好的融合蛋白通过PTD结构域穿膜进入到细胞内,根据SH2结构域结合底物的活性竞争结合底物分子的机制影响乳腺癌的增殖信号转导过程,从而达到干预肿瘤细胞生物学行为的目的。实验主要分为三部分:1.构建含有Grb2的SH2结构域的原核融合蛋白载体pET-16b-PTD-Grb2–SH2及其突变体对照载体,通过酶切、DNA电泳及质粒测序鉴定分子量和序列均正确无误后,用IPTG诱导原核蛋白表达,并经过镍柱纯化获取原核融合蛋白pET-16b-PTD-GRB2-SH2,SDS-PAGE凝胶分析此纯化蛋白确有表达并且分子量与预期一致。2.将纯化好的蛋白及其突变体对照蛋白加到培养的乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231细胞中,通过MTT实验、Transwell肿瘤迁徙实验、流式细胞凋亡检测和EdU增殖实验证明原核融合蛋白PTD-GRB2-SH2对乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231细胞的增殖以及迁移能力都有一定的抑制作用,但对凋亡有促进作用。3.应用Gateway系统构建含有Grb2的SH2结构域的真核融合蛋白载体plenti-PTD-Grb2–SH2及其突变体对照载体,通过酶切、DNA电泳及质粒测序鉴定分子量与序列正确无误后,利用三种慢病毒包装质粒转染后收取含病毒颗粒的上清,感染T淋巴瘤细胞系Jurkat细胞,用药物Blasticidin筛选稳定转染细胞株,Western blotting检测该基因修饰的Jurkat细胞能产生和分泌目的蛋白,从而证明真核融合蛋白表达载体构建完成。
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