论文部分内容阅读
目的:IL-29具有抗肿瘤和抗增殖的作用。最近有研究表明表达IL-29的重组新城疫病毒(Recombinant Newcastle Disease Virus expressing IL-29,r L-29)能引起胃癌细胞凋亡。也有学者指出内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)能诱发肿瘤细胞的自噬和凋亡。在本研究中,我们探讨内质网应激与r L-29引起人肺腺癌细胞A549凋亡的关系及其潜在的机制。方法:1.病毒感染细胞的鉴定运用Western Blot检测A549、SK-MES-1和Lewis细胞株IL-28R蛋白的表达水平;通过ELISA、PCR、免疫荧光检测病毒感染细胞后IL-29蛋白的表达。2.r L-29对A549细胞的增殖和迁移能力的影响将不同MOI的r L-29、NDV感染A549细胞,MTT检验其抑制率;通过克隆形成实验检测A549细胞的克隆形成率;运用划痕实验、transwell检验细胞的迁移。3.r L-29对A549细胞内质网应激及凋亡相关蛋白的影响运用Western Blot检验r L-29感染A549后内质网应激蛋白GRP78、CHOP、p-e IF2α的水平;免疫荧光观察GRP78、CHOP的表达;通过Western Blot检测凋亡蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase8、cleaved caspase9、BCL-2/Bax的表达情况。4.阻断内质网应激对r L-29感染的A549细胞发生自噬与凋亡的影响在r L-29处理A549前给予4PBA、si CHOP、si PERK进行干预,采用Western Blot分析内质网应激、自噬、凋亡蛋白的水平。5.阻断JNK信号通路对r L-29感染的A549细胞发生自噬和凋亡的影响以JNK抑制剂作用A549细胞后,MOI为10的r L-29、NDV病毒感染A549细胞24 h,采用Western Blot检测p-JNK、LC3II、cleaved caspase3的表达水平。6.干扰BCL-2后对r L-29引起的自噬及凋亡的影响通过FAM-si RNA BCL-2作用细胞,免疫荧光观察si RNA BCL-2转染效率;采用克隆形成实验检测细胞克隆情况;通过si BCL-2转染A549细胞,运用Western Blot分析A549细胞自噬相关蛋白(LC3、beclin1)、凋亡相关蛋白(cleaved caspase3)的表达量。7.r L-29在体内抑制A549细胞生长及部分机制本研究首先构建A549裸鼠肿瘤模型,并利用r L-29、NDV病毒液和等量PBS于裸鼠瘤体注射,定期测量裸鼠瘤体的大小,采用Western Blot观察其内质网应激蛋白GRP78、CHOP、p-e IF2α,自噬相关蛋白beclin1、LC3II,凋亡相关蛋白cleaved caspase3、BCL-2/bax的表达。结果:1.Western Blot发现IL-28R蛋白的表达在A549细胞株明显上升。与NDV组及对照组相比,ELISA、PCR、免疫荧光显示IL-29在r L-29组表达较高。2.MOI为10的r L-29和NDV病毒感染A549后,A549生长明显被抑制;r L-29组A549细胞的增殖及迁移能力较差。3.r L-29感染A549细胞后,Western Blot显示内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、p-e IF2α,凋亡相关蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase8、cleaved caspase9表达明显增加,BCL-2/Bax表达明显下降。免疫荧光显示r L-29组GRP78、CHOP的表达量上调。4.4PBA、si CHOP、si PERK处理后,内质网应激、自噬、凋亡蛋白表达量明显下调。5.JNK抑制剂处理后,Western Blot显示p-JNK、cleaved caspase3、LC3II水平显著降低。6.si RNA BCL-2转染成功;si BCL-2处理A549细胞后,A549细胞克隆形成率降低;Western Blot结果发现敲除BCL-2后,LC3、beclin1、cleaved caspase3水平升高。7.A549裸鼠肿瘤模型成功建立;r L-29、NDV病毒液和等量PBS于裸鼠瘤体注射后,r L-29组瘤体体积较NDV组和对照组小;Western Blot发现r L-29组GRP78、CHOP、p-e IF2α、beclin1、LC3II、cleaved caspase3的表达水平显著上调,BCL-2/Bax表达显著下调。结论:本实验通过r L-29处理A549细胞及肿瘤组织,证实了r L-29抑制了A549细胞的生长增殖和迁移能力,并在A549细胞及肿瘤组织中诱发内质网应激、自噬、凋亡。且证实了r L-29可通过内质网应激中PERK-e IF2α途径和IRE1/JNK/BCL-2途径诱导A549细胞发生自噬、凋亡。