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目的:探讨核心蛋白聚糖(DCN)基因联合白介素-24(IL-24)基因在体外对PBMC功能的影响。
方法:⑴构建重组质粒pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL-24。经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入大肠杆菌DH-5α中,大量提取pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL-24重组质粒;⑵利用脂质体2000将重组质粒pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL-24转入PBMC,鉴定转染效率,并通过RT-PCR检测细胞内DCN和IL-24的mRNA表达;⑶测定重组质粒对PBMC的影响:MTT法检测转染后PBMC的增殖、ELISA测定转染细胞IFN-r分泌水平、流式细胞技术(FCM)检测PBMC表面PD-1的表达。
结果:①构建的质粒经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切及PCR鉴定后,所得的基因片段与预期的基因片段大小相符;经DNA测序证实:序列与GenBank中IL-24的序列一致;②通过脂质体2000将重组质转入PBMC后,荧光显微镜下可见细胞内绿色荧光的表达;RT-PCR检测到细胞内有DCN和IL-24的mRNA表达;③MTT法检测细胞增殖:转染后96h、120h、144h,DCN与IL-24联合组的细胞增殖率明显高于DCN组,IL-24组,空质粒组,空白对照组,脂质体组;ELISA显示:DCN与IL-24联合组分泌IFN-γ的量显著高于其他组,有统计学差异(P<0.05);流式细胞技术(FCM)显示:PD-1受体的表达水平,联合组高于其它组。
结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-IL-24重组质粒;利用脂质体转染法将DCN和IL-24重组质粒转入PBMC,二者能显著促进PBMC的增殖,并增加IFN-γ的分泌及其表面PD-1受体的表达。提示DCN和IL-24联合对PBMC活性能显示更强的促进作用。