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目的:弱精子症（asthenozoospermia,AZS）定义为精子运动活力降低（进行性向前运动能力＜32%或总运动能力＜40%）,是最常见的男性不育症病因之一。本课题关注人类弱精子症潜在致病基因DNALI1,利用构建的小鼠同源基因Dnali1敲除模型,通过表型鉴定及相关生化实验明确了DNALI1是AZS新的致病基因。随后通过探索DNALI1蛋白在精子鞭毛组装中的作用,初步阐明DNALI1突变导致人和小鼠AZS的致病机制。方法:通过对本中心65例来自父母为近亲婚配家系的ASZ患者外周血行全外显子分析（whole exon sequencing,WES）,通过Sanger测序验证潜在致病基因的突变及其在先证者家系内的遗传模式。利用蛋白印迹（Western Blot,WB）、免疫荧光实验（immunofluorescence,IF）检测先证者精子中相应蛋白的表达丰度与表达定位;采用透射电镜（transmission electron microscope,TEM）分析精子鞭毛超微结构的异常改变。此外,我们通过CRISPR-Cas9编辑技术构建相应小鼠同源基因敲除（knockout,KO）模型,分析KO小鼠精子表型以明确候选AZS致病基因缺陷的致病性。随后通过免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）联合蛋白质谱分析技术（mass spectrometry,MS）探寻候选致病基因突变导致AZS的致病机制。最后,观察先证者接受卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）辅助生育治疗的临床妊娠结局。结果:通过WES检测,本课题在1例原发性不育的AZS患者中筛查出潜在致病基因DNALI1的纯合移码缺失突变（c.663666del.p.Glu221fs）。Sanger测序证实患者父母均为杂合突变携带者,符合孟德尔隐性疾病遗传规律。精液常规分析显示患者精子运动活力为0,WB和IF实验显示患者精子中DNALI1蛋白完全缺失。TEM检查显示患者精子纤维鞘（fibrous sheath,FS）结构对称性异常,同时,IF也检测到患者精子中纤维鞘相关蛋白AKAP4表达异常。为了进一步明确DNALI1基因突变与AZS的相关性,我们构建了Dnali1小鼠同源基因KO模型。KO小鼠同样表现出精子运动功能障碍,且TEM检查发现KO小鼠精子鞭毛轴丝同样存在FS的不对称性结构异常。上述人和小鼠的实验数据表明DNALI1基因突变是AZS新的致病因素。为了探寻DNALI1突变导致AZS的致病机制,本课题分析了人类精子DNALI1的免疫沉淀联合蛋白质谱的数据,发现DNALI1与动力蛋白重链蛋白DNAH1和DNAH12存在相互作用。此外,我们发现DNALI1突变患者精子中缺失部分动力蛋白重链,如DNAH1与DNAH7,而我们在DNAH1\7\10突变患者的精子中发现DNALI1蛋白并未缺失。表明DNALI1参与动力蛋白重链蛋白DNAH1和DNAH7的鞭毛组装;相反,DNAH1、DNAH7和DNAH10的缺失并不影响DNALI1在鞭毛内的组织。上述结论在Dnali1-KO小鼠中得到验证:KO小鼠精子中DNAH1与DNAH7同样缺失。为进一步研究DNALI1参与精子鞭毛轴丝组装的具体作用机制,我们检测了DNALI1在小鼠精子发生过程中的表达实相及表达定位。睾丸切片IF染色显示DNALI1蛋白开始表达于粗线期精母细胞胞质,睾丸单细胞悬液IF染色显示DNALI1在鞭毛形成前定位于的圆形精子胞浆,当鞭毛刚从细胞质中发出时,鞭毛上没有DNALI1信号,但在随后,DNALI1在精子鞭毛上组装。表明DNALI1除了能与IDA的组成部分结合在一起外,可能还具有其他功能。考虑到轻中链DNALI1连接重链DNAH1,形成IDA,我们检测了DNAH1蛋白的表达情况:在Dnali1-/-圆形精子胞质中检测到强烈的DNAH1信号,但该信号不延伸到鞭毛,表明DNALI1缺失不影响动力蛋白DNAH1的表达,但阻碍了其在鞭毛轴丝上的正常定位,揭示了DNALI1缺失造成弱精子症的致病机制。值得注意的是,DNALI1的缺失可导致人和小鼠精子鞭毛FS的结构不对称。此外纤维鞘蛋白AKAP3和AKAP4存在表达与定位的异常,表明DNALI1在精子发生过程中参与协调鞭毛轴丝FS的组装。为了进一步探讨其作用机制,我们通过免疫沉淀联合蛋白质谱技术。分析了小鼠睾丸组织DNALI1的相互作用蛋白。经过基因功能注释发现,DNALI1相互作用蛋白在蛋白激酶、糖代谢和离子通道中富集,这些都与FS活性有关。此外蛋白质组学分析揭示了DNALI1与dynein-1亚基以及dynactin复合物的多个亚基之间的潜在联系。由此我们推测DNALI1可能参与胞质动力蛋白的调节,从而调节纤维鞘的组装。结论:（1）DNALI1双等位基因突变可以导致人和小鼠AZS,DNALI1是AZS新的致病基因。（2）DNALI1基因突变导致人和鼠精子IDA和FS组装异常,DNALI1缺失导致部分动力蛋白重链组装失败,造成IDA结构异常,DNALI1蛋白缺失同时也造成纤维鞘相关蛋白表达与分布异常,引起纤维鞘组装异常,从而导致AZS。