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目的
DNA双链断裂(DSB)是最致命的DNA损伤类型之一。如果未能正确地修复DNA双链断裂会导致染色体畸变、基因组不稳定性和细胞死亡增加。DNA双链断裂的末端切除形成3单链DNA(ssDNA)对于启动DSB修复的同源重组(HR)途径至关重要。由于缺乏同源DNA作为模板，HR通路在G1期细胞中受到严格限制。核酸外切酶1(EXO1)是负责DSB末端切除的3ssDNA形成的关键分子。EXO1被报道通过泛素介导的蛋白酶体途径快速降解以应对DNA损伤。考虑到EXO1在G2期磷酸化并执行末端切除功能，目前尚不清楚EXO1磷酸化如何促进其泛素降解。此外，在G1期细胞中，DSBs的延长端切除应受到严格限制，目前还不清楚G1细胞EXO1活性的状态及其是否是决定G1细胞DSB修复途径的关键调控成分。因此，我们研究了细胞周期依赖性改变、EXO1活性/降解机制及其在调控G1期细胞DSB修复途径选择中的意义。
方法
(1)细胞培养与处理HeLa，MCF7，A549和U2OS细胞在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长。在室温下使用钴60γ射线源(北京放射医学研究所)以88.14cGy/min的剂量率照射细胞。Nu7026(Selleck)，MLN4924(MedChem Express)，MG132(Merck)，胸苷(TDR;Sigma-Aldrich)和环己酰亚胺(CHX; Sigma-Aldrich)的最终浓度为10μM，5μM，10μM，2mM和100μg/ml。
(2)质粒DNA和siRNA转染按照制造商的说明，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行质粒DNA和siRNA转染。标记FLAG的HA-Ub和SFB-Ub用于免疫共沉淀实验，以检测EXO1的泛素化水平。
(3)细胞同步和细胞周期分析将HeLa细胞与2mM胸腺嘧啶核苷孵育17h，在培养基中释放10h，然后再用胸腺嘧啶核苷处理13h。释放后在不同时间收集细胞用于细胞周期分析和蛋白质印迹。用预冷的PBS洗涤细胞，并用PBS中的10μg/mL碘化丙锭和100μg/mLRNase染色，然后通过荧光激活的细胞分选进行分析。
(4)免疫印迹和免疫沉淀测定用NETN300裂解缓冲液裂解细胞20分钟，然后在4℃以12000×g离心?15分钟。在分离全细胞提取物之后，通过蛋白质印迹分析进行蛋白质检测。对于免疫沉淀测定，将细胞裂解液与蛋白A/G琼脂糖和一抗孵育过夜。然后将琼脂糖珠子用裂解缓冲液洗涤3次，并重悬于SDS-PAGE上样缓冲液中，以使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析。
(5)免疫荧光染色法用PBS洗涤后，将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，并在室温下在0.25％TritonX-100溶液中孵育30分钟。用1％BSA封闭细胞，并与一抗孵育过夜。随后，将样品洗涤并与二抗孵育60分钟。进行DAPI染色以可视化核DNA。将盖玻片覆盖在载玻片上，并使用NikonECLIPSEE800荧光显微镜观察。
(6)通过免疫荧光检测ssDNA显微镜载玻片上的细胞在10μMBrdU中生长至少16h，然后用10Gy照射。将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，并在室温下在0.25％TritonX-100溶液中透化30分钟。将盖玻片在2MHCl中于37℃冲洗1小时，然后用0.1M硼酸钠中和30分钟。然后将细胞与一抗孵育过夜，并用二抗和DAPI复染，如前所述。
(7)逆转录PCR用Trizol试剂分离总RNA，并使用ReverTraAceqPCRRTMasterMix(Toyobo，FSQ-301)反转录。使用人β-肌动蛋白mRNA水平对SYBR-green实时RT-PCR结果进行标准化。
(8)菌落形成试验在HeLa细胞中用siRNA敲除RBX148小时。接下来，将细胞重新接种在六孔板中，并用2和4Gy照射。然后，将细胞在培养基中正常培养10天。用结晶紫将菌落染色，并在室温下风干。实验一式三份进行，显微镜下计数包含50个以上细胞的菌落数，以菌落数/细胞数×100％计算菌落形成率。
(9)中性彗星测定(单细胞凝胶电泳测定)进行中性彗星试验以检测DNA损伤。用RBX1siRNA转染HeLa细胞48小时，然后用4Gy辐照，并在不同时间收样以用于彗星试验。使用CASP软件确定彗星图像的尾矩。对于每个实验，从重复的玻片上计分50个细胞(总共100个细胞)，并将实验重复3次。
(10)统计分析结果表示为平均值±标准偏差，并且是根据从三个重复实验中获得的定量数据计算得出的。使用SPSSv17.0软件中的单向方差分析进行统计分析。使用LSD-t检验确定两组之间差异的显着性。p值≤0.05被认为是显著。
结果
(1)泛素化介导的EXO1降解在G1期被选择性激活。
(2)DNA-PKcs的S2056位点磷酸化在G1期的增加，并通过促进Cullin1的类泛素化(neddylation)修饰和激活SCFE3连接酶促进EXO1的降解。
(3)敲低Cullin1类泛素化激活分子RBX1促进IR诱导的EXO1降解以限制G1期的末端切除。
(4)敲除RBX1导致G1期细胞中末端切除和RAD51聚焦点形成增加。
(5)DNA-PKcs通过调节G1期RBX1-SCF/cullin1E3连接酶活性介导的EXO1的泛素化途径降解。
(8)DNA-PKcs的失活增加了DSB同源重组的DNA断裂末端的单链DNA(3?ssDNA)生成。
结论
EXO1在G1期通过SCFE3连接酶介导的泛素化和降解而失活。DNA-PKcs是这种细胞周期依赖性EXO1降解的主要调节因子，因此显着限制了末端切除，单链DNA末端的形成和G1期的HR活性，但在S期和G2期没有。此外，DNA-PK活性负责增加RBX1蛋白表达，限制DSB末端ssDNA的形成和抑制G1细胞中的HR修复途径。该研究为DNADSB修复途径的选择提供了新的细胞周期相关机制。
DNA双链断裂(DSB)是最致命的DNA损伤类型之一。如果未能正确地修复DNA双链断裂会导致染色体畸变、基因组不稳定性和细胞死亡增加。DNA双链断裂的末端切除形成3单链DNA(ssDNA)对于启动DSB修复的同源重组(HR)途径至关重要。由于缺乏同源DNA作为模板，HR通路在G1期细胞中受到严格限制。核酸外切酶1(EXO1)是负责DSB末端切除的3ssDNA形成的关键分子。EXO1被报道通过泛素介导的蛋白酶体途径快速降解以应对DNA损伤。考虑到EXO1在G2期磷酸化并执行末端切除功能，目前尚不清楚EXO1磷酸化如何促进其泛素降解。此外，在G1期细胞中，DSBs的延长端切除应受到严格限制，目前还不清楚G1细胞EXO1活性的状态及其是否是决定G1细胞DSB修复途径的关键调控成分。因此，我们研究了细胞周期依赖性改变、EXO1活性/降解机制及其在调控G1期细胞DSB修复途径选择中的意义。
方法
(1)细胞培养与处理HeLa，MCF7，A549和U2OS细胞在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长。在室温下使用钴60γ射线源(北京放射医学研究所)以88.14cGy/min的剂量率照射细胞。Nu7026(Selleck)，MLN4924(MedChem Express)，MG132(Merck)，胸苷(TDR;Sigma-Aldrich)和环己酰亚胺(CHX; Sigma-Aldrich)的最终浓度为10μM，5μM，10μM，2mM和100μg/ml。
(2)质粒DNA和siRNA转染按照制造商的说明，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行质粒DNA和siRNA转染。标记FLAG的HA-Ub和SFB-Ub用于免疫共沉淀实验，以检测EXO1的泛素化水平。
(3)细胞同步和细胞周期分析将HeLa细胞与2mM胸腺嘧啶核苷孵育17h，在培养基中释放10h，然后再用胸腺嘧啶核苷处理13h。释放后在不同时间收集细胞用于细胞周期分析和蛋白质印迹。用预冷的PBS洗涤细胞，并用PBS中的10μg/mL碘化丙锭和100μg/mLRNase染色，然后通过荧光激活的细胞分选进行分析。
(4)免疫印迹和免疫沉淀测定用NETN300裂解缓冲液裂解细胞20分钟，然后在4℃以12000×g离心?15分钟。在分离全细胞提取物之后，通过蛋白质印迹分析进行蛋白质检测。对于免疫沉淀测定，将细胞裂解液与蛋白A/G琼脂糖和一抗孵育过夜。然后将琼脂糖珠子用裂解缓冲液洗涤3次，并重悬于SDS-PAGE上样缓冲液中，以使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析。
(5)免疫荧光染色法用PBS洗涤后，将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，并在室温下在0.25％TritonX-100溶液中孵育30分钟。用1％BSA封闭细胞，并与一抗孵育过夜。随后，将样品洗涤并与二抗孵育60分钟。进行DAPI染色以可视化核DNA。将盖玻片覆盖在载玻片上，并使用NikonECLIPSEE800荧光显微镜观察。
(6)通过免疫荧光检测ssDNA显微镜载玻片上的细胞在10μMBrdU中生长至少16h，然后用10Gy照射。将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，并在室温下在0.25％TritonX-100溶液中透化30分钟。将盖玻片在2MHCl中于37℃冲洗1小时，然后用0.1M硼酸钠中和30分钟。然后将细胞与一抗孵育过夜，并用二抗和DAPI复染，如前所述。
(7)逆转录PCR用Trizol试剂分离总RNA，并使用ReverTraAceqPCRRTMasterMix(Toyobo，FSQ-301)反转录。使用人β-肌动蛋白mRNA水平对SYBR-green实时RT-PCR结果进行标准化。
(8)菌落形成试验在HeLa细胞中用siRNA敲除RBX148小时。接下来，将细胞重新接种在六孔板中，并用2和4Gy照射。然后，将细胞在培养基中正常培养10天。用结晶紫将菌落染色，并在室温下风干。实验一式三份进行，显微镜下计数包含50个以上细胞的菌落数，以菌落数/细胞数×100％计算菌落形成率。
(9)中性彗星测定(单细胞凝胶电泳测定)进行中性彗星试验以检测DNA损伤。用RBX1siRNA转染HeLa细胞48小时，然后用4Gy辐照，并在不同时间收样以用于彗星试验。使用CASP软件确定彗星图像的尾矩。对于每个实验，从重复的玻片上计分50个细胞(总共100个细胞)，并将实验重复3次。
(10)统计分析结果表示为平均值±标准偏差，并且是根据从三个重复实验中获得的定量数据计算得出的。使用SPSSv17.0软件中的单向方差分析进行统计分析。使用LSD-t检验确定两组之间差异的显着性。p值≤0.05被认为是显著。
结果
(1)泛素化介导的EXO1降解在G1期被选择性激活。
(2)DNA-PKcs的S2056位点磷酸化在G1期的增加，并通过促进Cullin1的类泛素化(neddylation)修饰和激活SCFE3连接酶促进EXO1的降解。
(3)敲低Cullin1类泛素化激活分子RBX1促进IR诱导的EXO1降解以限制G1期的末端切除。
(4)敲除RBX1导致G1期细胞中末端切除和RAD51聚焦点形成增加。
(5)DNA-PKcs通过调节G1期RBX1-SCF/cullin1E3连接酶活性介导的EXO1的泛素化途径降解。
(8)DNA-PKcs的失活增加了DSB同源重组的DNA断裂末端的单链DNA(3?ssDNA)生成。
结论
EXO1在G1期通过SCFE3连接酶介导的泛素化和降解而失活。DNA-PKcs是这种细胞周期依赖性EXO1降解的主要调节因子，因此显着限制了末端切除，单链DNA末端的形成和G1期的HR活性，但在S期和G2期没有。此外，DNA-PK活性负责增加RBX1蛋白表达，限制DSB末端ssDNA的形成和抑制G1细胞中的HR修复途径。该研究为DNADSB修复途径的选择提供了新的细胞周期相关机制。