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通过对黄芩毛状根培养体系的研究,表明黄芩毛状根能够有效合成黄芩药材中的次生代谢产物。在此基础上,本研究对黄芩毛状根生物转化对苯二酚合成熊果苷工艺进行研究。研究结果表明黄芩毛状根能将外加的对苯二酚生物转化合成熊果苷。本研究为熊果苷合成提供了新思路和新方法。主要研究内容与结果如下:
(1)黄芩毛状根中熊果苷和对苯二酚分析方法的研究:建立了高效液相色谱法测定熊果苷含量的方法,色谱条件为:waters-2487,Svmmetry-C18色谱柱(250mm×4.6mm,50μm),流速0.8mL/min,流动相:甲醇-水(15:85,v/v),检测波长:287nm,柱温:25℃,进样量:15μL。在该条件下,熊果苷的保留时间为5.4min,在100～200μg/mL内线性关系良好(r=0.9991),精密度的RSD=1.52%,稳定性的RSD=2.60%,平均加样回收率为98.56%～100.29%,RSD=0.83%。对苯二酚的保留时间为9.6min,在0.4～1.4μg/mL浓度范围内线性关系良好(r=0.9991)。
(2)熊果苷转化条件的研究:分别研究了培养基、转化时间、底物加入量对转化效果的影响。结果:采用改良的MS,50g/L蔗糖,10g/L葡萄糖,0.4mmol/L苯丙氨酸培养基时,每100mL培养液接种0.5g毛状根,培养20天,加入20mg/mL的对苯二酚水溶液1mL,转化40h,熊果苷的含量为4.43%(毛状根干重),对苯二酚的转化率为55.6%。黄芩毛状根对对苯二酚的最大耐受度为:0.2g/L。
(3)乙醇和表面活性剂对黄芩毛状根转化效果影响研究:通过对乙醇和吐温-80进行研究,表明乙醇对熊果苷的合成没有促进作用,吐温-80有促进对苯二酚通过细胞壁的作用。在加入底物转化的同时,每100mL培养液加入0.1g的Tween-80,熊果苷的含量为5.45%,对苯二酚的转化率85.2%,加入Tween-80使对苯二酚的转化率提高22.6%。
(4)熊果苷的提取分离纯化工艺:
1)提取:水提4h,料液比(1:20,w/v)。提取液浓缩一倍,过滤,制得熊果苷浓度为1g/L样品溶液。
2)大孔树脂除杂:D101树脂柱,上样量1mL/g树脂。4BV水洗脱,流速2BV/h。收集含熊果苷洗脱液。
3)硅胶柱精制:400目硅胶装柱,氯仿:甲醇(9:1,8:2,v/v)溶液洗脱,流速:0.2mL/min,收集含熊果苷部分,经氯仿:甲醇(80:20,v/v)重结晶,得熊果苷纯品。
(5)样品鉴定:样品的1H-NMR谱图δ:3.22-3.76(m,6H),4.80(1H,d,J=7.41),6.69(2H,d,J=5.88和2.24Hz),6.87(2H,d,J=5.85和3.69Hz),4.70(OH)。以上数据与文献报道一致,故将其鉴定为熊果苷。