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植物寄生线虫寄主广泛,每年在农业生产中造成巨大的经济损失。由于化学防治对环境污染严重并且威胁人畜的健康,生物防治越来越受到人们的关注。淡紫拟青霉是农业上一种非常重要的生防真菌,对植物寄生线虫具有很好的生防作用。此外,淡紫拟青霉对枯萎病、棉花蚜虫和切叶蚁等多种病虫害具有很好的防治作用。淡紫拟青霉能够寄生于线虫卵,在侵染的过程中,几丁质酶和丝氨酸蛋白酶等多种水解酶类和蛋白酶类发挥重要作用。次级代谢产物也在防控病虫害过程中起了不可或缺的作用。Leucinostatins是从淡紫拟青霉发酵液中分离到的一种脂肽类抗生素,具有抗肿瘤细胞、抗细菌、抗真菌、抗锥形虫等生物活性。对于leucinostatins分子生物学方面的研究,包括合成基因以及合成途径,目前还没有报道。本研究的目的是通过对两个淡紫拟青霉菌株（PLBJ-1和PLFJ-1）进行基因组测序,揭示淡紫拟青霉的基因组特征,鉴定leucinostatins合成酶基因簇,解析leucinostatins的合成途径。为了开展淡紫拟青霉基因功能的研究,开发了该菌的PEG介导的原生质体遗传转化体系。对淡紫拟青霉菌株PLBJ-1进行了GFP转化。紫外光激发下,转化菌株在荧光显微镜下发出绿色荧光,并且单孢继代培养六代后,荧光能够稳定遗传。基因组数据表明,PLBJ-1和PLFJ-1的基因组大小分别为38.14 Mb和38.53 Mb,分别含有144和163个scaffold,两个菌株的重复序列含量分别为6.07%和6.00%,分别预测出11773和11763个蛋白编码基因。PLBJ-1与PLFJ-1的共线性分析表明两个菌株具有很好的共线性关系。对淡紫拟青霉的主要蛋白家族进行预测,发现两个菌株均具有较多的水解酶类、蛋白酶类和致病相关蛋白等家族的合成基因。用单拷贝同源蛋白构建的系统发育分析表明,与淡紫拟青霉关系最近的是Tolypocladium inflatum和Tolypocladium ophioglossoides,三个线虫寄生菌（淡紫拟青霉、Hirsutella minnesotensis和Pochonia chlamydosporium）分别与昆虫寄生菌（T.inflatum、Ophiocordyceps sinensis和Metarhizium anisopliae）聚到同一分支上,说明线虫寄生菌与昆虫寄生菌很可能具有共同的祖先。淡紫拟青霉的基因组中共编码13个PKS、10个NRPS、两个PKS-like、10个NRPS-like、1个DMATS、4个TS和1个PKS-NRPS杂合体,表明淡紫拟青霉具有很大的天然产物开发的潜力。基于leucinostatins的结构以及淡紫拟青霉中次级代谢产物合成基因的预测,确定了VFPBJ02539为leucinostatins合成酶的候选基因。对lcsA基因进行同源敲除,得到VFPBJ02539基因功能缺失的转化子ΔlcsA。对PLBJ-1的野生型菌株与突变体ΔlcsA发酵液的粗提物进行HPLC比较分析,发现与野生型菌株的粗提物相比,ΔlcsA的粗提物少了两种物质。对这两个峰进行质谱鉴定,同时与leucinostatin A和B的标准品比对分析,结果表明ΔlcsA缺失的两个物质为leucinostatin A和B,证明了NRPS合成酶基因lcsA负责leucinostatins的生物合成。比较在两种培养基（诱导leucinostatins产生的Lab-made-PDB和非诱导leucinostatins产生的PDB-BD）中与lcsA相关的基因表达情况,发现lcsG到lcs T共20个基因处于共表达的状态。转录组数据以及野生型和ΔlcsA中q RT-PCR的分析结果均表明:共20个基因（lcsA-lcsT）参与了leucinostatins的生物合成,基因簇中包括1个NRPS合成酶和两个PKS合成酶,还包括一些修饰酶类,如O-甲基转移酶lcsG、细胞色素P450、ABC转运蛋白、转录因子、氨基转移酶、硫酯酶、Acyl-CoA连接酶、tRNA合成酶等。对脂肽类化合物合成途径中的关键酶PKS（lcsC）、连接酶（lcsD）和硫酯酶（lcsE）分别进行了基因敲除,获得了敲除突变体ΔlcsC,ΔlcsD和ΔlcsE。对野生型以及突变体菌株的发酵液粗提物进行HPLC比较分析,发现在Δlcs C,ΔlcsD和ΔlcsE的发酵液中,leucinostatin A和B是缺失的,其HPLC谱与ΔlcsA一致,确定了这几个酶在leucinostatins生物合成过程中的关键作用。通过对lcs基因簇内特异性转录因子lcs F的过表达,提高了leucinostatins的产量,也确定了转录因子lcsF对于整个基因簇的调控作用。据此推导了leucinostatins的合成途径:在PKS的催化作用下,乙酰CoA分子和丙二酸单酰Co A分子合成了短脂肪酸链4-甲基-六碳-2-烯酸;在连接酶（lcsD）和硫酯酶（lcsE）的催化作用下,4-甲基-六碳-2-烯酸连接到NRPS合成酶Lcs A的第一个模块的第一个结构域上。Lcs A具有10个模块,能够激活10个氨基酸,在C结构域的催化下,这些氨基酸缩合为多肽链。Lcs A C末端的R结构域负责中间代谢产物多肽链的释放。中间代谢产物经过转胺、羟基化以及不同程度的甲基化等修饰步骤后,最终形成了leucinostatin A和B。野生型淡紫拟青霉（PLBJ-1）与马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）和辣椒疫霉病菌（P.capsici）进行对峙培养,P.infestans和P.capsici菌落的生长受到抑制;leucinostatins缺失的ΔlcsA与P.infestans和P.capsici对峙培养,这两株卵菌生长的抑制作用消失;leucinostatins过表达的菌株OE::lcs F与卵菌对峙培养,抑制作用增强。这些结果说明了淡紫拟青霉能够抑制卵菌的生长,这种抑制作用主要是由于leucinostatins的存在而产生的。综上所述,本研究对两个淡紫拟青霉菌株进行了基因组测序,通过与其他真菌的比较基因组分析,揭示了淡紫拟青霉的基因组特征。通过淡紫拟青霉的遗传转化体系,对次级代谢产物相关基因进行了基因敲除与功能鉴定,确定了leucinostatins的合成酶基因,并且对合成途径进行了推导。簇内转录因子的过表达确定了lcsF对整个基因簇中基因表达的调控作用,同时提高了leucinostatins的产量。此外,通过淡紫拟青霉与卵菌的对峙培养,确定了淡紫拟青霉对卵菌生长的抑制作用,缺失leucinostatins的菌株对卵菌的抑制作用消失,证明leucinostatins对卵菌具有生物活性。