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背景:心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床上常见的一种心律失常,可明显增加心血管患病率和死亡率,目前的西药和手术治疗都有其局限性,中医药的治疗方法对于AF的防治具有独特优势。稳心颗粒(Wenxin Keli,WXKL)由党参、黄精、三七、甘松、琥珀等药组成,具有益气养阴、活血化瘀之功,被广泛应用于AF的治疗当中。由于WXKL防治AF的整体动物模型仍缺少系统性的研究,其临床疗效的针对性机制尚不明确,故需行进一步研究。目的:1.运用网络药理学的方法,预测WXKL防治AF的作用靶标和信号通路,并构建稳心颗粒-房颤生物网络,揭示WXKL抗AF的多成分、多靶点、多通路的作用机制。2.观察 WXKL 对交感性房颤(sympathetic atrial fibrillation,SAF)大鼠的 AF 诱发率、AF持续时间的影响,并对所预测网络靶标进行初步验证,为进一步探索WXKL防治SAF的机制打下基础。方法:1.在WXKL防治AF的网络靶标预测研究中,通过检索中药化学成分数据库TCMSP、TCM-mesh来获取WXKL的化学成分和作用靶标,检索基因疾病数据库CTD、OMIM、TTD来获得AF的相关靶标,并通过STRING数据库来整合蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络,采用Cytoscape软件来构建稳心中药PPI网络与房颤PPI网络,并通过网络拓扑分析得到以上两个网络的关键靶标。将这两个网络取交集,构建稳心中药-房颤PPI网络,使用插件MOCDE对稳心中药-房颤PPI网络进行聚类分析,从而识别核心聚类模块,最后运用DAVID数据库对核心模块靶标进行GO生物功能富集分析、KEGG通路富集分析,对结果进行分析总结。2.通过异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)联合食道Burst刺激构建SAF大鼠模型,以WXKL作为观察药,胺碘酮作为阳性对照药,两种药物提前干预两周,并设立单纯电刺激组与ISO联合电刺激组进行对比,通过电生理仪监测观察各组的心率变化、死亡率、AF诱发率、AF持续时间。3.通过 Quantitative real-time PCR 实验方法,检测各组大鼠的 PI3K、AKT1、NOS3、RYR2基因的相对表达量,从而对WXKL的预测结果进行初步的实验验证。结果:1.网络靶标预测分析(1)从TCMSP、TCM-mesh数据库获取WXKL有效成分236个,靶蛋白699个,将靶蛋白映射至STRING数据库,共得到695个靶标,并构建稳心中药PPI网络,通过网络拓扑分析得到该网络的1 13个核心节点,这些节点多与细胞增殖、生长、代谢、分化、凋亡,神经递质与内分泌激素、炎症反应、血管内环境等相关。(2)从CTD、OMIM、TTD数据库获取有关AF的324个基因,以上基因映射至STRING数据库,得到285个疾病靶标,构建房颤PPI网络,网络拓扑分析得到该网络的1 10个核心节点,这些节点多与离子通道、细胞增殖与凋亡、炎症反应、血管内环境等相关。(3)稳心中药-房颤PPI网络中包含80个靶标,稳心中药PPI网络调控了 84.38%度值大于50的房颤PPI网络中的节点,经聚类分析,共得到5个模块,而得分大于5的核心模块有2个,核心模块中主要包括AKT1、NOS3、ADRB1、RYR2、KCNH2、SCN5A、VEGFA等靶标。(4)通过GO、KEGG分析,发现WXKL主要在蛋白质合成转运、细胞增殖与凋亡、心脏传导与心率调节、激素内分泌、血管内环境、氧化应激与炎症反应等生物学功能方面调控AF的发生发展,并可能通过PI3K-AKT信号通路、心肌细胞的肾上腺素能信号、TNF信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等发挥作用。2.动物实验药效学探索:(1)死亡率:与正常对照组相比,ISO联合电刺激组(P<0.01)、WXKL低剂量组(P<0.05)、胺碘酮组(P<0.05)大鼠死亡率增高;与单纯电刺激组相比,ISO联合电刺激组死亡率增高(P<0.05);与ISO联合电刺激组相比,WXKL高剂量组大鼠的死亡率降低(P<0.05)。(2)心率:各组大鼠给药两周后,与正常对照组和单纯电刺激组相比,胺碘酮组(P<0.001)和ISO联合电刺激组(P<0.01)大鼠的心率显著降低;而与胺碘酮组相比,WXKL低剂量、WXKL高剂量组初始心率较快(P<0.05),心率维持更加稳定。在腹腔注射ISO后,各组大鼠的心率比初始心率普遍增长20%左右。经电刺激后,各组大鼠心率比电刺激前普遍降低10-20 bpm。(3)AF诱发率:与正常对照组相比,其他各组AF的诱发率都显著增加(P<0.01)表明模型较为稳定;与单纯电刺激组相比,ISO联合电刺激组大鼠的AF诱发率增高,但是无统计学差异;与ISO联合电刺激组相比,WXKL高剂量组AF的诱发率降低,但是无统计学差异。(4)AF持续时间:与正常对照组相比,其他各组AF的持续时间显著延长(P<0.05);与单纯电刺激组(12.7±5.2s)相比,大鼠腹腔注射ISO后能显著延长AF的持续时间(421.50±130.1s,P<0.01);相比ISO联合电刺激组,WXKL高剂量组(24.7±13.1s,P<0.01)和胺碘酮(19.8±12.2s,P<0.01)显著缩短了 AF的持续时间。3.网络靶标验证与正常对照组相比,ISO联合电刺激组PI3K、AKT1、NOS3、RYR2的表达都显著降低;相比ISO联合电刺激组,WXKL高剂量组、胺碘酮组中AKT1、NOS3、RYR2表达显著升高,PI3K也有所升高,但无统计学差异。结论:本研究通过网络靶标预测的方法得出,WXKL防治AF的网络靶标主要包括AKT1、NOS3、ADRB1、RYR2、KCNH2、SCN5A、VEGFA 等,并初步阐释了 WXKL 防治 AF的生物学功能主要体现在蛋白质合成转运、细胞增殖与凋亡、心脏传导与心率调节、激素内分泌、血管内环境、氧化应激与炎症反应等方面,WXKL可能通过PI3K-AKT信号通路、心肌细胞的肾上腺素能信号、TNF信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等通路发挥防治AF的作用。动物实验结果发现,WXKL能缩短ISO联合电刺激诱导的大鼠AF的持续时间,一定程度减少房颤的诱发率,并能降低大鼠的死亡率。网络靶标验证得出,WXKL可能通过调节PI3K、AKT1、NOS3、RYR2来抑制细胞凋亡、改善内皮功能、维持心肌Ca2+稳态从而抑制AF的发生发展。该动物模型的建立及对其作用机制的初步验证为进一步探索WXKL防治SAF的作用机制打下基础。