研究背景和研究目的结直肠癌是常见的恶性肿瘤,已经成为我国三大癌症之一,在西方发达国家,结直肠癌是仅次于肺癌的第二位恶性肿瘤。30～40%的结直肠癌患者行根治性手术治疗和放化疗等综合性治疗后发生肝肺转移,一旦出现转移很快威胁到患者的生命。因此,阐明结直肠癌转移的分子机制,控制转移是当前研究的重要方向。目前认为,转移的肿瘤细胞所经历的粘附特性的丧失、运动能力的增强、表达蛋白水解酶及新生血管形成等一系列改变,是侵袭和转移必不可少的过程。当遇到各种细胞内外信号刺激时,肿瘤细胞随时、精确地改变形状和运动行为需要肌动蛋白和微管蛋白的不断重建,使细胞内的微丝、叶状伪足、层状伪足、侵袭性伪足等不断发生动态改变,从而适应侵袭和转移等过程。伪足形成和细胞形态改变是侵袭转移的起始步骤,细胞迁移头部高度动态性伪足结构的形成依赖肌动蛋白单体聚合和肌动蛋白纤维的延长。丝状伪足和层状伪足在肿瘤侵袭起始阶段起粘附作用,侵袭性伪足与细胞外基质降解密切相关。前期工作中,我们筛选出在高转移结直肠癌细胞中表达上调的FMNL2基因,是重要的肌动蛋白成核因子,并首次探讨了FMNL2在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制,结果显示FMNL2在结直肠癌细胞株和组织中高表达,且与淋巴结转移相关;它能通过诱导上皮-间质转化,促进结直肠癌细胞侵袭和转移;此外,HMGA1/miR-137/FMNL2轴参与结直肠癌侵袭和转移。文献报道,FMNL2作为Cdc42的效应蛋白促进层状伪足尖端的肌动蛋白聚合和微丝的延长促进细胞的运动;FMNL2作为RhoC的效应蛋白促进癌细胞的圆形和阿米巴虫样或间充质样侵袭迁移。由此可见,FMNL2能够调节肌动蛋白相关的癌细胞侵袭和运动,然而其具体机制是什么?是否有相互作用蛋白参与其中?该作用受到哪些信号通路的调节?以上问题尚不清楚,目前有关FMNL2相互作用蛋白的研究尚未见报道。本研究将对FMNL2相互作用蛋白进行筛选,从中选择作用于结直肠癌细胞运动和侵袭的候选蛋白,从侵袭性伪足的角度进一步阐述其参与结直肠癌侵袭和转移的分子机制。旨在揭示FMNL2参与结直肠癌转移的新机制,为临床干预肿瘤转移提供新的潜在应用靶点。研究方法1.FMNL2相互作用蛋白的筛选和鉴定1)利用酵母双杂交试验初步筛选FMNL2的相互作用蛋白,结合文献选择可能作用于癌细胞运动和侵袭的一个基因作为研究靶点；2)分别以FMNL2、SHANK2、cortactin抗体进行免疫共沉淀；3)荧光共聚焦分别观察FMNL2和SHANK2,FMNL2和cortactin、FMNL2、 SHANK2和cortactin的共定位；4)利用Western Blot和Q-PCR检测30对人结直肠癌细胞株中相互作用蛋白FMNL2、SHANK2、cortactin的表达；免疫组化检测人结直肠癌组织中FMNL2、SHANK2、cortactin的表达;并进行相关性分析；2.FMNL2在侵袭性伪足形成中的作用1)在4株人结直肠癌细胞中,利用免疫双荧光标记cortactin和F-actin观察侵袭性伪足的形态和数目；2)利用免疫双荧光标记FMNL2与F-actin,观察FMNL2与侵袭性伪足的共定位；3)以pEGFP-C1为骨架构建actin表达载体：瞬时转染SW620细胞,利用活细胞成像技术观察侵袭性伪足的动态改变；4)利用阳离子脂质体法将FMNL2-SiRNA (以NC-SiRNA为对照)瞬时转染Lovo和SW620细胞,pCDNA3.0-FLAG-FMNL2-CT(以pCDNA3.0-FLAG为对照)瞬时转染HT29和SW480细胞48h后,行Western Blot和Q-PCR鉴定；5)在Lovo/SiFMNL2、SW620/SiFMNL2、SW480/FMNL2和HT29/FMNL2细胞中,进行TRITC-鬼笔环肽和cortactin免疫荧光共定位观察,比较转染前后侵袭性伪足的形态和数量；6)将Lovo/SiFMNL2、SW620/SiFMNL2、SW480/FMNL2和HT29/FMNL2细胞铺入猪源性绿色荧光明胶制备的共聚焦小皿中进行原位明胶降解实验,比较转染前后细胞基质胶降解能力的差异；7)在Lovo/SiFMNL2和HT29/FMNL2细胞中,利用扫描电镜观察FMNL2对侵袭性伪足的形态及基质胶降解的影响；8)在SW620/SiFMNL2和SW480/FMNL2细胞中,利用透射电镜观察FMNL2对侵袭性伪足形态的影响；3.FMNL2/SHANK2在侵袭性伪足形成中的作用1)在Lovo/SiFMNL2、SW620/SiFMNL2、SW480/FMNL2和HT29/FMNL2细胞中,利用Western Blot检测SHANK2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin的表达水平,利用Q-PCR检测SHANK2、cortactin mRNA水平；2)利用阳离子脂质体法,分别将cortactin-SiRNA和SHANK2-SiRNA瞬时转染入SW480/FMNL2以及HT29/FMNL2细胞中,行Western Blot和Q-PCR鉴定转染效率；3)将cortactin-SiRNA和SHANK2-SiRNA分别瞬时转染SW480/FMNL2以及HT29/FMNL2细胞,利用Transwell小室检测干扰前后癌细胞迁移和侵袭能力的变化；4)将cortactin-SiRNA和SHANK2-SiRNA分别瞬时转染SW480/FMNL2以及HT29/FMNL2细胞,利用免疫荧光共定位和原位明胶降解实验,检测癌细胞侵袭性伪足数目和基质降解能力的变化；4.FMNL2与SHANK2、cortactin相互结合结构域的初步分析1)在SW480/FMNL2-CT-FLAG、SW480/FMNL2-NT-FLAG、SW480/ctrl细胞中,分别以cortactin抗体和SHANK2抗体免疫共沉淀FLAG;2)以pGEX-6p-1为骨架构建cortactin及截短子原核表达载体；以pCDNA3.0-FLAG为骨架构建FMNL2(525-616A)和FMNL2(617-1092A)截短子真核表达载体；3)利用IPTG诱导pGEX-6p-1-cortactin及截断子转化的BL21(DE3)感受态细菌表达GST融合蛋白；利用阳离子脂质体法将pCDNA3.0-FLAG-FMNL2(525-616a)和FMNL2(617-1092a)分别瞬时转染入SW480细胞中表达；利用GST-pull down实验沉淀FLAG;5.EGF/Cdc42调控FMNL2诱导的侵袭性伪足形成1)在SW620/SiFMNL2细胞中,给予hEGF刺激,利用Cdc42-pull down检测Cdc42-GTP的表达水平；利用Western Blot检测FMNL2、SHANK2、cortactin、 p-(tyr466/421)cortactin)、Cdc42的表达水平；2)在HT29/FMNL2细胞中,给予酪氨酸受体激酶抑制剂AG1478处理,利用Cdc42-pull down检测Cdc42-GTP的表达水平；利用Western Blot检测FMNL2、SHANK2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin, Cdc42的表达水平；3)将Cdc42-SiRNA-1/-2/-3瞬时转染SW620细胞,行Western Blot和Q-PCR鉴定；4)在SW620/SiCdc42细胞中给予hEGF刺激,行Western Blot检测Cdc42、 FMNL2、SHANK2、cortactin的表达水平；5)将Cdc42-SiRNA和pRK5-Cdc42Q61L组成型活性质粒共转染SW620细胞后,Western Blot检测Cdc42、FMNL2、SHANK2、cortactin的表达水平；6)在SW620/SiFMNL2和Lovo/SiFMNL2细胞中给予hEGF刺激,观察癌细胞中侵袭性伪足数量和基质胶降解能力的变化；7)将FMNL2-SiRNA和pRK5-Cdc42Q61L组成型活性质粒共转染至SW620和Lovo细胞,观察癌细胞中侵袭性伪足的数量和基质胶降解能力的变化。8)将FMNL2-SiRNA和pRK5-Cdc42Q61L组成型活性质粒共转染至SW620和Lovo细胞,利用Transwell小室检测转染前后癌细胞迁移和侵袭能力的变化；9)将HT29/FMNL2和SW480/FMNL2细胞给予酪氨酸激酶抑制剂AG1478抑制,观察处理后细胞侵袭性伪足和基质胶降解能力的变化。研究结果1.FMNL2相互作用蛋白的筛选和鉴定1)利用酵母双杂交试验,初步筛选7个FMNL2的相互作用蛋白包括COMMD10、EGFL6、ZNF38、ENO3、SHANK2、DNAJA1、RBM16,其中SHANK2(Cortactin-SH3domain-binding protein; cortactin-binding protein1)是cortactin的结合蛋白,而cortactin是侵袭性伪足形成的关键蛋白,由此,我们选择SHANK2作为进一步研究的靶点；2)FMNL2免疫共沉淀检测到SHANK2和cortactin; SHANK2免疫共沉淀检测到FMNL2和cortactin; cortactin免疫共沉淀检测到SHANK2和FMNL2;以上说明FMNL2、SHANK2和cortactin三者存在相互作用；3) FMNL2与SHANK2共定位于癌细胞胞膜和胞浆,FMNL2与cortactin共定位于胞膜和胞浆,FMNL2与SHANK2、cortactin三色共定位于胞膜和胞浆；4) SHANK2和cortactin在高转移潜能的Lovo和SW620细胞中高表达,而在低转移潜能的SW480和HT29细胞中低表达,与FMNL2的表达趋势一致。FMNL2与SHANK2的表达存在显著正相关(r=0.898, P=0.000), FMNL2与cortactin的表达存在显著正相关(r=0.872,P=0.000)；人结肠癌组织中癌中表达FMNL2、SHANK2和cortactin,三者的表达趋势较一致。SHANK2和FMNL2存在显著正相关关系(r=0.604, P=0.00), cortactin与FMNL2也存在显著正相关关系(r=0.545, P=0.002), SHANK2与cotactin也存在正相关关系(r=0.602,P=0.00)。2.FMNL2在侵袭性伪足形成的作用1)获得瞬时转染FMNL2-SiRNA-1/-2/-3的SW620细胞,Q-PCR检测干扰效率分别是0.65,0.57,0.61；获得瞬时转染FMNL2-SiRNA-1/-2/-3的Lovo细胞,Q-PCR检测干扰效率分别是0.60,0.58,0.63；获得瞬时转染pCDNA3.0-FL AG-FMNL2-CT的HT29和SW480细胞,Q-PCR检测过表达效率分别是111.268和126.630倍。Western Blot验证了FMNL2干扰后其表达明显下调,FMNL2过表达后其表达明显上调；2)4株人结直肠癌细胞中均出现侵袭性伪足,红色F-actin与绿色cortactin共定位于胞核周围。Lovo细胞侵袭性伪足表现为环状和圆形粗大的颗粒以及少量散在点状的颗粒,大约18.2%的细胞出现侵袭性伪足；SW620细胞侵袭性伪足表现为梅花状或者散在的点状颗粒,大约79.35%的细胞出现侵袭性伪足；SW480细胞侵袭性伪足表现为梅花状或者散在的点状颗粒,较SW620细胞明显小,大约17.26%的细胞出现侵袭性伪足；HT29细胞侵袭性伪足表现为散在细小的点状颗粒,大约11.87%的细胞出现侵袭性伪足。与SW620细胞比较,Lovo, SW480和HT29细胞侵袭性伪足的含量较少,具有统计学差异(P=0.000；P=0.000; P=0.000), Lovo与SW480、HT29细胞比较,侵袭性伪足的含量没有统计学差异(P=0.784, P=0.074), SW480和HT29细胞比较,侵袭性伪足的含量没有统计学差异(P=0.123)；3)红色F-actin与绿色FMNL2可共定位于胞膜和胞核周围,呈现黄色荧光,在胞核周围团块状和颗粒状黄色荧光是FMNL2与侵袭性伪足的共定位；4)获得瞬时转染的SW620/actin细胞,自发绿色荧光；活细胞实时荧光成像观察到SW620/actin细胞内细颗粒状和团块状的侵袭性伪足,呈现动态变化的过程；5)扫描电镜可见HT29/control细胞腹侧面侵袭性伪足细小数目少,基质胶表面较平滑,细胞轻轻地停留其上,HT29/FMNL2细胞腹侧面侵袭性伪足较粗较长、数目较多,细胞下基质胶受侵袭性伪足的粘附和降解作用出现明显的破坏,细胞较牢固的扎根于基质胶；Lovo/NC细胞腹侧面侵袭性伪足粗长,数量多,细胞下基质出现明显的降解和破坏,Lovo/SiFMNL2细胞腹侧面侵袭性伪足细小数目少,大部分基质胶表面较平滑,细胞轻轻地停留其上；6)透射电镜观察到SW620细胞核的一侧出现大量粗大的线粒体聚集,其间有一些圆形和不规则形的高密度匀质的团块,沿着平行排列的微丝分布,即侵袭性伪足：当SW620细胞FMNL2沉默后,细胞核周围线粒体的聚集消失,在少量散在分布的线粒体之间,可见少量高密度匀质的团块,微丝结构消失,部分侵袭性伪足形态模糊不清。在SW480细胞中未见明显的线粒体聚集,其间可见少量圆形和不规则形的高密度匀质的团块,当SW480细胞过表达FMNL2后,在细胞核的一侧出现明显的线粒体聚集,其间出现多个粗大不规则形的高密度匀质团块,还观察到了层状平行排列的高尔基体朝向侵袭性伪足。7)以SW620/NC细胞侵袭性伪足(86.52±2.61%)为对照,SW620/SiFMNL2细胞侵袭性伪足变小,含量显著减少(29.64±3.01%,P=0.000)以Lovo/SiNC细胞侵袭性伪足(20.09±2.64%)为对照,Lovo/SiFMNL2细胞侵袭性伪足变小,含量显著减少(9.35±1.46%,P=0.000)；以HT29/ctrl细胞侵袭性伪足(11.90±2.13%)为对照,HT29/FMNL2细胞侵袭性伪足变大、含量显著增多(30.67±3.50%,P=0.000),以SW480/ctrl细胞细胞侵袭性伪足(19.64-1.62%)为对照,SW480/FMNL2细胞侵袭性伪足变大、含量显著增多(77.95±3.75%,P=0.000)；8)以SW620/NC细胞明胶降解率(89.12±4.70%)为对照,SW620/SiFMNL2细胞明胶充分降解率显著下降(31.90±3.23%,P=-0.000)以Lovo/NC细胞明胶降解率(18.00±3.55%)为对照,Lovo/SiFMNL2细胞基质胶充分降解率显著下降(6.77±1.22%,P=0.007)；以HT29/ctrl细胞明胶降解率(9.96±1.23%)为对照,HT29/FMNL2细胞明胶降解率显著增高(31.20±3.63%,P=0.001),以SW480/ctrl细胞明胶降解率(15.47±1.93%)为对照,SW480/FMNL2细胞明胶降解率显著增高(76.69±4.17%,P=0.000)；3.FMNL2/SHANK2在侵袭性伪足形成中的作用1) Lovo/SiFMNL2和SW620/SiFMNL2细胞中SHANK2、cortactin、 p-(tyr466/421)cortactin蛋白明显表达下降,Lovo/SiFMNL2细胞中SHANK2、 cortactin mRNA水平下降(0.68, P=0.000;0.55, P=0.001); SW620/SiFMNL2细胞中SHANK2、cortactin mRNA水平下降(0.76, P=0.000;0.68, P=0.001); SW480/FMNL2和HT29/FMNL2细胞中SHANK2、cortactin、 p-(tyr466/421)cortactin蛋白水平明显上升,SW480/FMNL2细胞中SHANK2、 cortactin mRNA水平升高(4.17,P=0.003;9.60, P=0.000), HT29/FMNL2细胞中SHANK2、cortactin mRNA水平升高4.50倍(4.50,P=0.000；7.32,P=0.000)2)在SW480/FMNL2细胞中瞬时转染SHANK2-SiRNA-1/-2/-3,干扰效率分别是0.88、0.72、0.86,在SW480/FMNL2细胞中瞬时转染cortactin-SiRNA-1/-2/-3,干扰效率分别是0.36、0.56、0.58；HT29/FMNL2细胞中瞬时转染SHANK2-SiRNA-1/-2/-3,干扰效率分别是0.81、0.66、0.87,在HT29/FMNL2细胞中瞬时转染cortactin-SiRNA-1/-2/-3,干扰效率分别是0.47、0.75、0.78；Western Blot检测到SW480/FMNL2/SiSHANK2和HT29/FMNL2/SiSHANK2细胞中SHANK2蛋白水平明显下降,cortactin蛋白水平不改变；SW480/FMNL2/SiSHANK2和HT29/FMNL2/Sicortactin细胞中cortactin蛋白水平明显下降,SHANK2蛋白水平不改变；3)迁移和侵袭实验结果显示：以SW480/FMNL2/NC迁移率(319.8±28.4)为对照,SW480/FMNL2/SiCortactin和SW480/FMNL2/SiSHANK2细胞的迁移能力均显著下降(78.4±12.5,P=0.000；108.8±11.8,P=0.000)；以SW480/FMNL2/NC侵袭率(284.4±28.3)为对照,SW480/FMNL2/SiCortactin和SW480/FMNL2/SiSHANK2细胞的侵袭能力也显著下降(60.8±9.1,P=0.000;91.0±13.4,P=0.000)；以HT29/FMNL2/NC迁移率(18.8±3.8)为对照,HT29/FMNL2/SiCortactin和HT29/FMNL2/SiSHANK2细胞的迁移能力显著下降(1.6±0.9,P=0.000；3.0±0.7,P=0.000)；以HT29/FMNL2/NC侵袭率(14.4±3.8)为对照,HT29/FMNL2/SiCortactin和HT29/FMNL2/SiSHANK2细胞的侵袭能力也显著下降(1.8±0.8,P=0.004；4.0±1.0,P=0.007)；以HT29/FMNL2/NC侵袭性伪足(30.31±3.81%)为对照,HT29/FMNL2/SiSHANK2细胞侵袭性伪足变小,数目不显著变化(26.00±2.25%, P=0.026); HT29/FMNL2/Sicortactin细胞侵袭性伪足变小,数目显著减少(8.13±1.40%,P=0.000)；以SW480/FMNL2/NC侵袭性伪足(78.52±4.06%)为对照,SW480/FMNL2/SiSHANK2细胞侵袭性伪足变小,数目显著减少(60.72±3.03%, P=0.000); SW480/FMNL2/Sicortactin细胞侵袭性伪足变小,数目显著减少(18.42±2.17%,P=0.000)；4)以HT29/FMNL2/NC明胶降解率(30.07±3.02%)为对照,HT29/FMNL2/SiSHANK2细胞明胶降解率显著下降(24.43±2.33%,P=0.026),HT29/FMNL2/Sicortactin细胞明胶降解率显著下降(7.97±1.37%,P=0.000)；以SW480/FMNL2/NC明胶降解率(81.17±2.37%)为对照,SW480/FMNL2/SiSHANK2细胞明胶降解率显著下降(61.60±3.85%,P=0.000),SW480/FMNL2/Sicortactin细胞明胶降解率显著下降(19.36±2.06%,P=0.000)；4.FMNL2与SHANK2、cortactin相互结合结构域的初步分析1) SHANK2免疫共沉淀结果显示,在SW480/FMNL2-CT细胞中检测到FLAG,在SW480/FMNL2-NT细胞以及SW480/ctrl细胞中未检测到FLAG,说明SHANK2与FMNL2-CT存在相互作用,与FMNL2-NT不存在相互作用；2) cortactin免疫共沉淀结果显示,在SW480/FMNL2-CT细胞中检测到FLAG,在SW480/FMNL2-NT细胞以及SW480/ctrl细胞中未检测到FLAG,说明cortactin与FMNL2-CT存在相互作用,与FMNL2-NT不存在相互作用；3)成功构建了cortactin及截短子原核表达载体：pGEX-6p-1-cortactin (1-550a)、pGEX-6p-l-cortactin (1-325a)、pGEX-6p-l-cortactin (83-495a)、 pGEX-6p-1-cortactin (326-550a)、pGEX-6p-l-cortactin (496-550a)和FMNL2截短子真核表达载体：pCDNA3.0-FLAG-FMNL2(525-616a)、FMNL2(617-1092a);4)成功表达了GST融合蛋白：GST-cortactin (1-550a)、GST-cortactin (1-325a)、GST-cortactin (83-495a)、GST-cortactin (326-550a)和GST-cortactin (496-550a);成功表达FLAG融合蛋白：FLAG-FMNL2(525-616a)、 FL AG-FMNL2(617-1092a);5) GST-pull down结果显示,在SW480/FMNL2-CT细胞和SW480/FMNL2(525-616a)细胞中检测到FLAG,在SW480/FMNL2-NT、 SW480/FMNL2(617-1092a)和SW480细胞/ctrl未检测到FLAG,说明cortactin (496-550a)即cortactin-SH3直接结合FMNL2(525-616a)。5. EGF/Cdc42调控FMNL2诱导的侵袭性伪足形成1)将SW620/SiFMNL2以及SW620/NC细胞给予hEGF刺激,细胞中FMNL2、SHANK2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin、Cdc42、Cdc42-GTP的表达水平明显升高；2)将HT29/FMNL2以及HT29/ctrl细胞给予酪氨酸激酶抑制剂AG1478处理,细胞中FMNL2、SHANK2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin、Cdc42、 Cdc42-GTP的表达水平明显减少；3) Q-PCR检测SW620细胞Cdc42-SiRNA-1,2,3瞬时转染后沉默效率分别是0.83、0.74、0.87,Western Blot验证了该蛋白表达下调：4) Western Blot检测到SW620/SiCdc42细胞中Cdc42、FMNL2、SHANK2、 cortactin蛋白表达水平下调,S W620/SiCdc42/Cdc42Q61L细胞中Cdc42、 FMNL2、SHANK2、cortactin蛋白表达水平较SW620/SiCdc42细胞组明显升高；5)在SW620/SiCdc42细胞中给予hEGF刺激,Western Blot检测到细胞中Cdc42、FMNL2、SHANK2、cortactin蛋白表达水平明显升高；6)以SW620/SiFMNL2细胞侵袭性伪足(36.06±5.69%)为对照,SW620/SiFMNL2细胞给予hEGF刺激后侵袭性伪足显著增多(82.95±5.53%,P=0.000)增大；SW620/SiFMNL2/Cdc42Q61L细胞中侵袭性伪足显著增多(75.48±5.06%,P=0.000)增大；以Lovo/SiFMNL2细胞侵袭性伪足(9.37±1.67%)为对照,Lovo/SiFMNL2细胞给予hEGF刺激后侵袭性伪足显著增多(19.42±2.83%,P=0.001)增大；Lovo/SiFMNL2/Cdc42Q61L细胞中侵袭性伪足显著增多(19.17±1.90%,P=0.000)增大；7)以SW620/SiFMNL2细胞明胶降解率(36.93±4.40%)对照,SW620/SiFMNL2细胞给予hEGF刺激后,明胶降解率显著升高(92.24±2.43%,P=0.000); SW620/SiFMNL2/Cdc42Q61L细胞明胶降解率显著升高(88.36±2.72%,P=0.000)；以Lovo/SiFMNL2细胞明胶降解率(9.14±1.94%)为对照,Lovo/SiFMNL2细胞给予hEGF刺激后明胶降解率显著增多(20.25±2.86%, P=0.001); Lovo/SiFMNL2/Cdc42Q61L细胞明胶降解率显著增多(19.81±1.68%,P=0.001)；8) Transwell小室检测结果显示：以SW620/SiFMNL2细胞迁移率(193.0±15.6)为对照,给予hEGF刺激后细胞迁移率显著升高(304.8±14.3,P=0.000), SW620/SiFMNL2/Cdc42Q61L细胞迁移率显著升高(276.2±14.2,P=0.000)。以SW620/SiFMNL2细胞侵袭率(109.0±11.47)为对照,给予hEGF刺激后细胞侵袭率显著升高(243.0±13.9,P=0.000),SW620/SiFMNL2/Cdc42Q61L细胞侵袭率显著升高(207.0±18.23,P=0.000)。以Lovo/SiFMNL2细胞迁移率(156.2±14.9)为对照,给予hEGF刺激后细胞迁移率显著升高(295.8±17.0, P=0.000), Lovo/SiFMNL2/Cdc42Q61L细胞迁移率显著升高(277±17.2,P=0.000)以Lovo/SiFMNL2细胞侵袭率(77.6±8.3)为对照,给予hEGF刺激后细胞侵袭率显著升高(217.8±18.1,P=0.000),Lovo/SiFMNL2/Cdc42Q61L细胞侵袭率显著升高(197.4±15.0,P=0.000)。10)以HT29/FMNL2细胞侵袭性伪足(30.00±±3.44%)为对照,给与AG1478抑制后细胞侵袭性伪足显著减少(11.89±1.89%,P=0.000)变小,以SW480/FMNL2细胞侵袭性伪足(80.76±3.44%)为对照,给与AG1478抑制后细胞侵袭性伪足显著减少(18.89±2.57%,P=0.000)变小；11)以HT29/FMNL2细胞明胶降解率(35.19±6.00%)对照,给予AG1478抑制后细胞明胶降解率显著下降(10.11±±2.06%,P=0.002),以SW480/FMNL2细胞明胶降解率(81.69±±4.12%)对照,给予AG1478抑制后细胞明胶降解率显著下降(16.69±±2.86%,P=0.000)。结论1. FMNL2不仅通过支架蛋白SHANK2与cortactin作用,还直接与cortactin相互作用；2. FMNL2-CT段与SHANK2直接结合,FMNL2-FH1与cortactin-SH3直接结合；3. FMNL2促进人结直肠癌细胞侵袭性伪足的形成;4. SHANK2和cortactin是FMNL2诱导侵袭性伪足形成所必需的；5. hEGF/Cdc42信号通路在上游调控FMNL2诱导结直肠癌侵袭性伪足的形成。创新性1.阐述FMNL2参与结直肠癌侵袭和转移的新机制,即FMNL2与侵袭性伪足关键蛋白cortactin存在直接或间接(通过支架蛋白SHANK2的桥接)作用,FMNL2通过SHANK2或cortactin促进结直肠癌细胞侵袭性伪足的形成,该作用受到上游hEGF/Cdc42信号通路的正向调节；2.为临床干预结直肠癌转移提供新的潜在应用靶点。