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高产奶牛产后泌乳早期处于能量负平衡状态,在此过程中奶牛机体内的体脂被大量动员,通过脂肪酸的氧化供能,来应答泌乳早期能量摄入的不足。肝脏是脂肪酸代谢的中心器官,大量动员的体脂以非酯化脂肪酸(NEFA)的形式进入肝脏。当过量的NEFA进入肝脏后,超过肝脏代谢能力时,肝脏的代谢机能发生紊乱,导致奶牛发生酮病。酮病使奶牛生产和繁殖性能下降,给奶牛养殖业造成经济损失。本研究旨在探讨围产期奶牛能量负平衡状态下肝脏基因、miRNA表达及血液代谢物和LEP等指标的变化特征。了解一些小分子和激素(β羟丁酸(BHBA)、烟酸、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和LEP(LEP)对肝细胞生酮酶表达的影响,探讨了酮病的发病机制及影响因素。 本研究首先对产后能量负平衡奶牛肝脏的表达谱数据进行分析,通过整合来自于基因芯片和转录组测序的基因表达谱数据,获得了严重能量负平衡(SNEB)和温和能量负平衡(MNEB)奶牛肝脏的差异表达基因(DEGs)。通过对这些DEGs的深入分析,获得了在芯片和RNA-seq数据集中同时差异表达的关键基因。同时对这些差异表达基因进行了生物功能的挖掘,获得了在SNEB过程中显著富集的生物学功能和通路。结果表明:1)芯片中识别为DEGs为491个,在RNA-seq数据集中差异表达的基因为330个,而在芯片数据集和RNA-seq数据集中同时差异表达的基因为153个,这153个基因被定义为Hub-gene;2)显著富集到的通路有6个,主要涉及脂肪酸降解、PPAR通路等脂类代谢相关通路。DEGs显著富集的基因本体论(GO)条目,主要涉及代谢过程。 其次,对奶牛SNEB过程中肝脏miRNA表达谱数据进行了整合分析。通过比较SNEB奶牛和MNEB奶牛肝脏的miRNA表达谱数据,获得了在SNEB过程中差异表达的miRNA。通过对这些差异表达miRNA靶基因的预测,同时结合基因芯片的基因表达数据,获得了miRNA和mRNA的调控网络,对其深入分析,找到了miRNA在参与调控SNEB过程中的可能的通路和分子作用。这些信息的获得,为从整体水平上研究奶牛产后能量负平衡过程的应答提供了有益的参考。通过miRNA-mRNA的整合分析,差异表达miRNA的靶基因显著富集的通路为AMPK和脂肪细胞因子信号通路,而显著富集的本体论条目也主要是涉及糖代谢、脂类代谢等过程。 酮病是一种奶牛产后常见的能量代谢紊乱性疾病,按照有无临床症状分为临床型和亚临床型。LEP是脂肪细胞产生的多肽类激素,可抑制饲料摄入量、提高能量开支,是调节能量代谢动态平衡的重要激素。为了评估荷斯坦奶牛血浆LEP浓度与产后酮病发生的关系,对15头奶牛的血浆LEP、酮体(KB)、葡萄糖和总脂浓度进行了测定,测定时间从产前1周至产后7周。根据酮体水平(阈值1.722mmol/L)将奶牛分为亚临床酮病组(SK)和非亚临床酮病(NSK)组,对以上指标结果进行组间比较,分析了LEP与KB间的相关性。与NSK奶牛相比,SK奶牛产前LEP浓度明显较低。产前1周血浆LEP浓度与其他各周的酮体浓度呈负相关。结论,荷斯坦奶牛产后SK发生与产前LEP水平降低有关,产前血浆LEP浓度低(奶牛消瘦)可作为奶牛产后亚临床酮病的预测因素。 奶牛酮病的主要临床血液生化特征是高血酮、低血糖。酮体主要成分是BHBA、乙酰乙酸和丙酮3种物质的混合物,它们在动物体内按一定比例组成(70%∶28%∶2%)。而血液中的酮体,主要来自于肝脏,羟甲基戊二酸辅酶A合成酶(HMGCS2)和羟甲基戊二酸辅酶A裂解酶(HMGCL)是肝脏生酮过程的关键酶,它们的表达状况直接影响了肝脏酮体生成的水平。为了研究酮体生成酶表达的影响因素,实验研究了BHBA、烟酸、胰岛素、LEP和IGF-1对肝细胞生酮酶表达的影响。同时,根据SNEB表达谱数据分析结果,检测了PPARα和CPT-1两种调控肝脏脂肪酸代谢过程中发挥重要作用的基因。本研究采用原代培养的犊牛肝细胞为模型,利用荧光定量PCR和Elisa方法检测了酮体生成酶和部分脂类代谢相关基因的表达情况。 实验初步建立了HMGCS2、HMGCL、PPARα和CPT-1等基因的荧光定量检测方法,建立了奶牛原代肝细胞的分离和培养方法。 在细胞实验中,对原代肝细胞添加不同浓度的BHBA(0.5、1.0、3.0、5.0mM/L)、烟酸(2、8、32μM/L)、胰岛素(10、50、100nM/L)、LEP(10、50、100ng/ml)、IGF-1(10、50、100ng/mL),分别检测了HMGCS2、HMGCL、PPARα和CPT-1的表达。结果表明-1)BHBA(5mM/L)能够显著下调HMGCS2、HMGCL、CPT-1和PPARα的表达。2)高水平烟酸(32μM/L)显著下调HMGCS2、HMGCL、CPT-1和PPARα的表达。3)胰岛素对HMGCS2和HMGCL表达没有影响,高水平的胰岛素(100nM/L)显著下调了CPT-1和PPARα的mRNA表达。4)LEP对HMGCS2和HMGCL的表达没有影响,高水平的LEP(50,100ng/ml)显著上调了CPT-1和PPARα的mRNA表达。5)高水平的IGF-1(100ng/mL)显著下调了HMGCS2的表达,显著下调了CPT-1的mRNA表达。说明BHBA可能参与肝脏生酮作用的调控,胰岛素、LEP可能不是调控肝脏生酮作用的重要因素。 结论:1)在奶牛SNEB过程中,主要发生改变的是PPAR通路,及脂类和糖类代谢相关的通路,涉及的生物学过程主要是以物质代谢过程为主。2)在SENB过程中,miRNA可能通过调控AMPK和脂肪细胞因子信号通路,来参与调控奶牛能量负平衡过程。3)奶牛产前低血浆LEP浓度与产后酮病的发生有关;相对于正常奶牛,过瘦的奶牛容易发生酮病。4)高水平的BHBA和烟酸均显著抑制了HMGCS2和HMGCL的mRNA和蛋白的表达,也显著抑制了CPT-1和PPARα的mRNA表达。5)高浓度的Insulin、LEP和IGF-1能够影响脂类代谢相关基因CPT-1和PPARα的mRNA表达,高水平的IGF-1显著抑制了HMGCS2的表达,但Insulin和LEP对上述2种肝脏生酮酶表达几无影响,对影响酮体生成酶表达的影响因素还有待进一步的研究。